豬繁殖與呼吸綜合征病毒與宿主細胞受體之間相互作用的研究及病毒遺傳變異分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是以妊娠母豬繁殖障礙及各年齡階段豬呼吸道癥狀為主要特征的傳染病.其病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)具有典型的嗜單核細胞/巨噬細胞特性,在體內(nèi),PRRSV主要感染豬肺泡巨噬細胞(porcine alveola

2、r'macrophages,PAM).研究發(fā)現(xiàn)在PAM細胞上存在PRRSV的3個受體:硫酸乙酰肝素(Heparin sulphate,HS)和唾液酸粘附素(Sialoadhesin.Sn)和CD163分子.三者之間的關(guān)系大體為:HS主要作用是吸附PRRSV到PAM細胞上,Sn介導PRRSV的內(nèi)吞,CD163可能起協(xié)助Sn內(nèi)吞、病毒脫衣殼和將基因組RNA釋放到細胞質(zhì)中的作用.HS和Sn構(gòu)成PRRSV進入PAM細胞的第一個環(huán)節(jié),PRRSV與

3、Sn結(jié)合是實現(xiàn)內(nèi)吞的必要步驟.但是迄今為止Sn受體上參與病毒結(jié)合的部位,病毒上參與受體結(jié)合的蛋白及其結(jié)合位點還不得而知. 為確定Sn受體上參與病毒結(jié)合的結(jié)構(gòu)域,本試驗從PAM細胞中經(jīng)RT-PCR擴增出編碼Sn受體的全長基因,并克隆到pcDNA3.1載體中,得到表達Sn受體的真核表達載體.豬PKl5細胞為PRRSV非允許細胞,將表達載體轉(zhuǎn)染PKl5細胞后接種PRRSV,然后利用針對PRRSV的單克隆抗體進行間接免疫熒光檢測病毒的吸

4、附情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達有sn蛋白的PK15細胞可以結(jié)合PRRSV.在此基礎(chǔ)上,本試驗進一步將該受體基因分割成幾段進行轉(zhuǎn)染PK15細胞、檢測細胞與病毒的吸附能力,最終發(fā)現(xiàn)該受體的第一個結(jié)構(gòu)域(20-136aa)單獨轉(zhuǎn)染的PKl5細胞可以介導PRRSV的吸附.繼而利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)對該結(jié)構(gòu)域進行了原核表達,目的蛋白經(jīng)純化后免疫試驗兔并制備了針對該結(jié)構(gòu)域的兔高免血清.該高免血清可以明顯抑制病毒與PAM細胞的吸附.試驗證實唾液酸粘附素受體的

5、第一個結(jié)構(gòu)域參與PRRSV與PAM細胞的吸附. 分析結(jié)果顯示,在PRRSV各結(jié)構(gòu)蛋白中均不存在七肽重復序列,特別是在PRRSV僅有的兩個Ⅰ型膜蛋白GP2、GP4中也沒有發(fā)現(xiàn)七肽序列.這表明PRRSV侵入PAM細胞不是Ⅰ型膜融合機制,而是按照其它類型的機制進行的.為分析PRRSV中參與受體分子結(jié)合的病毒囊膜蛋白,本試驗從PRRSV的純化產(chǎn)物中提取病毒的囊膜蛋白,病毒囊膜蛋白與宿主細胞PAM進行感作后,分別利用針對GP2、GP3、G

6、P5和N蛋白的單克隆抗體進行間接免疫熒光檢測.結(jié)果發(fā)現(xiàn)GP5蛋白的單克隆抗體可以檢測到熒光,而GP2和GP3蛋白的單克隆抗體檢測不到熒光.N蛋白單克隆抗體能檢測到少量熒光.由于N蛋白位于病毒粒子的內(nèi)部,一直以來被認為不參與受體的結(jié)合.存在少量熒光,可能是在提取的膜蛋白殘留少量的完整病毒粒子所致.通過以上試驗,可以認為GP5蛋白參與了受體的結(jié)合.另一方面,GP5蛋白的熒光集中在細胞的表面,同時GP5蛋白的拓撲結(jié)構(gòu)分析顯示,GP5與受體結(jié)合

7、后有可能引起局部自由能的升高,從而可能導致病毒結(jié)構(gòu)的變化,因此推測,除GP5蛋白以外的其他囊膜蛋白有可能參與了PRRSV的吸附與內(nèi)吞. GP5蛋白在不同的PRRSV分離株中遺傳變異較人.本研究收集了我國大陸白1996年首次發(fā)現(xiàn)PRRSV以來至2006年初的42株P(guān)RRSV GP5序列,其中包括GenBank登錄的所有的大陸分離株.GP5序列27株,從現(xiàn)地病料中自行分離的毒株序列15株.對這些毒株的GP5序列分析結(jié)果表明:所檢測的

8、42株P(guān)RRSV均為北美洲型;尤為注意的是我國這些毒株可以分為差異極大的兩個亞群,在整個北美洲型毒株的進化樹上呈明顯的兩極分布.亞群1毒株在氨基酸序列上與亞群2有著很人的差別,特別是亞群1毒株在主要中和表位PNE序列中高度變異,而且潛在的毒力相關(guān)位點也與強毒相同.另外,亞群1與我國廣泛使用的弱毒苗和滅活苗的親緣關(guān)系較遠.因此從一定程度上講,亞群1毒株具有毒力較強、逃避機體體液免疫的潛質(zhì).地理分布顯示,亞群1主要集中在我國的東南沿海地區(qū).

9、 2006年春夏交接之際,我國南方發(fā)生以高熱、高發(fā)病率和高死亡率為特征的豬病,而后迅速蔓延至周邊地區(qū),至2007年已遍及全國絕人部分省份.目前認為該疫情是由高致病性PRRSV變異株及其他病原微生物混合感染并在高溫高濕等誘因條件下所致.本研究對我國2006～2007年多個省份分離的高致病性PRRSV變異株進行了全基因組序列分析,結(jié)果顯示這些毒株各蛋白的氨基酸序列之間同源性極高,有的甚至可達100﹪,而且遺傳變異特征相同,因此它們可