豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及DNA疫苗的初步研究.pdf

1、1.本研究采集PRRS疑似病料，在Marc-145細(xì)胞上進(jìn)行病毒分離，盲傳3代，出現(xiàn)細(xì)胞病變。根據(jù)GenBank中PRRSV美洲株保守N基因序列設(shè)計(jì)合成了一對(duì)引物，利用RT-PCR方法從分離毒株細(xì)胞培養(yǎng)物中擴(kuò)增出大小約374bp片段。病毒在Marc-145細(xì)胞上培養(yǎng)36h后做免疫熒光試驗(yàn)(IFA)，出現(xiàn)明顯的綠色熒光。證明分離到一株P(guān)RRSV毒株。
　　 2.根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的PRRSVVR2332毒株GP5的基因序列

2、，設(shè)計(jì)合成了兩對(duì)引物，針對(duì)GP5蛋白的含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的引物p1/p2和針對(duì)GP5蛋白非中和表位缺失含有HindⅢ、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的引物tGP5.1/tGP5.2，RT-PCR擴(kuò)增GP5基因和tGP5基因的DNA序列，克隆于真核表達(dá)載體pcDNA3.1中，經(jīng)PCR、酶切鑒定及DNA序列測(cè)定，表明插入的片段具有正確的閱讀框，同時(shí)證明分離毒株為美洲株。
　　 3.pcDNA3.1、真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-

3、GP5和pcDNA3.1-tGP5用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染Marc-145，于37℃5％CO2培養(yǎng)細(xì)胞48h，提取總RNA做RT-PCR，結(jié)果pcDNA3.1-GP5轉(zhuǎn)染孔在603bp處出現(xiàn)目的條帶，pcDNA3.1-tGP5轉(zhuǎn)染孔在495bp處出現(xiàn)目的條帶，表明兩個(gè)重組質(zhì)粒在細(xì)胞中得到轉(zhuǎn)錄。同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)染孔做免疫熒光試驗(yàn)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GP5、pcDNA3.1-tGP5質(zhì)粒的細(xì)胞均出現(xiàn)明顯熒光，證明重組質(zhì)粒在Mar

4、c-145中得到有效表達(dá)。
　　 4.用TIANGEN公司質(zhì)粒大提試劑盒大提質(zhì)粒pcDNA3.1-GP5，pcDNA3.1-tGP5和空載體pcDNA3.1，將三種質(zhì)粒及PBS免疫小鼠4次，每次間隔2周，每次免疫后兩周用ELISA、病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)抗PRRSV抗體。結(jié)果表明pCDNA3.1-GP5和pCDNA3.1-tGP5均能在小鼠體內(nèi)有效誘導(dǎo)ELISA抗體和中和抗體，從而為進(jìn)一步發(fā)展有效的疫苗、為PRRS的防制提供了一定的指