豬繁殖與呼吸綜合征病毒遺傳變異分析及豬α干擾素的真核表達(dá).pdf

1、PRRSV屬于RNA病毒,其基因組容易發(fā)生變異,變異分布于整個基因組,其中以Nsp2和GP5基因的變異最大,因此對Nsp2和GP5基因變異的分析在一定程度上可以反映整個病毒基因組變異的情況。本研究對9株P(guān)RRSV分離株NSP2和GP5基因同時進(jìn)行序列分析,比較其變異結(jié)果是否一致,進(jìn)一步探尋PRRSV流行株遺傳變異規(guī)律；豬α干擾素具有廣泛的抗病毒作用,而真核表達(dá)的豬α干擾素具有與天然豬α干擾素相同的生物學(xué)活性,因此研究真核表達(dá)的豬α干擾素

2、對防治PRRSV具有重要的生物學(xué)意義。
　　 擴增自2006至2009年期間從河南省不同地區(qū)分離的9株P(guān)RRSV株NSP2和GP5編碼基因,并進(jìn)行序列測定和分析,結(jié)果顯示,9株分離株NSP2全長2850bp-2937bp,編碼950-979個氨基酸,GP5基因全長603bp,編碼200個氨基酸。將除HeN-3株外的其余8株分離株NSP2核苷酸序列與國內(nèi)外典型株CH-1a、BJ-4、HB-1(sh)、HB-2(sh)和VR2332

3、株進(jìn)行比對,其同源性分別為91.1％-92.4％、82.3％-83.1％、94.7％-96％、87.15-87.9％、82.6%-83.5％,與河南株HN0701和HN0702的同源性為95.45-98.4％和94.1％-95.6％,而HeN-3株與BJ-4、VR2332和RespPRRSMLV株的同源性分別為99.2％、99.5％和99.5％。將除HeN-3株外的其余8株分離株GP5基因核苷酸序列與國內(nèi)外典型株CH-1a、BJ-4、H

4、B—1(sh)、HB-2(sh)和VR2332株進(jìn)行比對,其同源性分別為95.2％-96.7％、94％-95.2％、95.5％-96.7％、91.9％-92.5％和88.7％-89.6％,與河南株HN0701和HN0702的同源性分別為96.5％-99.2％和96.7%-99.7％,而HeN-3株與BJ-4、VR2332和RespPRRSMLV株的同源性為98.7％、99％和99.2％,對NSP2和GP5基因同時繪制遺傳進(jìn)化樹顯示,He

5、N-3株與BJ-4、VR2332和RespPRRSMLV株屬于一個亞型,其余8株與CH-1a、HB-1(sh)、HB-2(sh)、HN0701和HN0702株屬于一個亞型,由此得到NSP2和GP5基因的變異結(jié)果基本一致,對NSP2和GP5中的任何一個基因進(jìn)行遺傳變異分析,都可以獲得PRRSV的遺傳變異信息。
　　 無菌采集健康豬前腔靜脈血,分離淋巴細(xì)胞,提取總RNA,參照GenBank上已發(fā)表的豬α干擾素基因序列設(shè)計包括豬α干擾

6、素完整開放閱讀框的一對引物,應(yīng)用RT-PCR方法擴增豬α干擾素基因序列,回收目的片段并將其插入到PTG19-T載體中,轉(zhuǎn)化DH-5α感受態(tài)細(xì)胞,將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序,獲得豬α干擾素完整開放閱讀框為570bp,其核苷酸與GenBank上發(fā)表的豬α干擾素序列同源性均在95.0％以上。用EcoRⅠ和XhoI對質(zhì)粒PTG19-T-poIFNα進(jìn)行雙酶切,回收目的基因片段,插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.0中,構(gòu)建豬α干擾素真核表達(dá)重組

7、質(zhì)粒pcDNA3.0-poIFNα,將重組質(zhì)粒pcDNA3.0-poIFNα轉(zhuǎn)染至PK-15細(xì)胞,用G418進(jìn)行篩選。收集轉(zhuǎn)染后的PK-15細(xì)胞,提取poIFNα的mRNA,經(jīng)過PCR檢測獲得預(yù)期目的片段；應(yīng)用豬α干擾素ELISA試劑盒對豬α干擾素表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得豬α干擾素表達(dá)蛋白的表達(dá)量為883.94pg/ml；通過實驗室建立的豬α干擾素?zé)晒舛縋CR方法,檢測豬α干擾素mRNA轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果與對照組相比,豬α干擾