豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白親和肽篩選與鑒定.pdf

1、本實驗根據(jù)GenBank發(fā)表的PRRSV北美洲分離株（VR-2332）毒株的基因序列，利用Oligo和Primer5.0軟件設計了一對擴增GP5蛋白基因的引物。從疑似藍耳病的豬內分離到PRRSV，在Marc-145細胞中盲傳5-6代，出現(xiàn)較為明顯的細胞病變，收獲病毒液將其反復凍融3次進行病毒RNA的提取，反轉錄PCR，成功的擴增出全長為603個堿基的GP5基因片段。序列比較表明與已發(fā)表的VR-2332病毒毒株的GP5蛋白基因序列的同源率

2、為91.5％；經(jīng)BLAST搜索，擴增的GP5基因與CH-1α同源性最高，為99.2％。該毒株被命名為HH08。
　　 通過對PRRSVHH08株GP5基因序列分析，設計2對引物，通過PCR擴增獲得了不含信號肽和跨膜功能區(qū)的GP5基因片段，長度分別為121bp和248bp。應用酶切位點相連構建融合基因技術，將兩段基因亞克隆到原核表達載體中獲得了重組質粒pET-GP5。構建的重組質粒在E.coliRosetta中進行原核表達。SDS

3、-PAGE結果表明有大小約為18Ku的蛋白表達，與預計大小相符。Western-blot檢測結果顯示表達的蛋白能被天然PRRSV陽性豬血清所識別，同時此蛋白抑制PRRSV對Marc-145細胞的感染。將重組蛋白免疫新西蘭白兔，制備多抗，經(jīng)間接ELISA結果顯示多抗血清效價可達217。將PRRSVHH08包被ELISA檢測多抗血清的特異性，發(fā)現(xiàn)血清特異性較好，GP5蛋白血清具有抗中和病毒的活性，間接免疫熒光結果顯示多抗血清能夠用于PRRS

4、V的特異性檢測。
　　 利用噬菌體隨機十二肽庫，以GP5重組融合蛋白為靶分子，對其進行了四輪生物淘選。對第四輪洗脫物隨機選出的20個噬菌體單克隆的核苷酸序列測定及多肽序列的推導結果表明，經(jīng)過對靶分子的四輪篩選后，最終篩選出8種高親和力的十二肽。將最高親和力的2個序列進行合成，分別為KHMHWHPPALNT（K）；HWGNHSKSHPQR（H）。競爭ELISA方法對合成多肽的檢測結果說明多肽K、H均能與GP5重組蛋白結合。病毒抑制

5、試驗表明所篩選出的多肽具有良好的生物活性。
　　 為了檢測多肽體內的抗病毒活性，本實驗以BALB/c小鼠為試驗動物，進行免疫學實驗。將小鼠分成5組，即V+K組（病毒加K噬菌體組）、V+H組（病毒加H噬菌體組）、V+S組（病毒加對照S噬菌體組）、V組（病毒加PBS組）和C組（空白對照組）。首免PRRSVHH08株，24h后分別免疫K、H、S噬菌體，免疫后在第7d、14d、21d、28d進行血液采集，ELISA方法檢測小鼠血清樣本中