豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP1非結(jié)構(gòu)蛋白B細胞表位和ORF3-7結(jié)構(gòu)蛋白T細胞表位的解析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是嚴重威脅世界各國養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一。PRRSV感染可引起母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病，并導致機體產(chǎn)生免疫抑制。PRRSV分為歐洲型和美洲型兩個血清型，病毒基因組ORF1編碼13種非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2-7編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白，其中NSP1能夠抑制IFN-β啟動子活性和Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。本研究成功制備出

2、6株針對NSP1蛋白的單克隆抗體，并鑒定獲得兩個線性表位（54-59aa和157-163aa）和一個不連續(xù)性表位(185-232aa)。同時，利用生物信息學和IFN-γ ELISPOT試驗在ORF3-7編碼蛋白上鑒定出7個T細胞表位，并根據(jù)T、B細胞表位設計合成兩種新的抗原分子。構(gòu)建成功的真核表達質(zhì)粒，可以有效表達目的蛋白，小鼠基因免疫試驗證明，SynBT2重組質(zhì)粒DNA可有效誘導產(chǎn)生細胞和體液免疫應答，為PRRSV疫苗研究奠定重要基礎

3、。
　　 主要研究內(nèi)容分為以下4個部分:
　　 1.豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP1非結(jié)構(gòu)蛋白原核表達與單克隆抗體研制
　　 根據(jù)GenBank Accession No.EU144079，設計針對PRRSV SY0608 NSP1基因的特異性引物，擴增獲得長1149bp的特異性DNA片段。將目的片段克隆至原核表達載體pET-32a中，通過IPTG誘導含pET-32a-NSP1的大腸桿菌BL21，證明重組蛋白獲得有

4、效表達。SDS-PAGE和Western blot分析證明，NSP1可以自身裂解形成NSP1α和NSP1β。37℃條件下誘導表達，重組蛋白主要形成包涵體，以NSP1全長蛋白的形式存在。18℃條件下誘導，重組NSP1蛋白可以完全裂解為NSP1α和NSP1β。Western blot分析表明，重組蛋白均可被豬源PRRSV陽性血清所識別。將純化的重組NSP1蛋白與等量弗氏佐劑乳化，經(jīng)頸背部多點皮下注射免疫BALB/c小鼠3次后，取脾細胞與SP

5、2/0骨髓瘤細胞融合，經(jīng)間接ELISA、Western blot和IFA，篩選獲得PRRSV NSP1抗體陽性雜交瘤細胞，經(jīng)過3次亞克隆后，最終獲得6株能穩(wěn)定分泌抗NSP1抗體的陽性雜交瘤細胞株。間接ELISA、IFA和Western blot鑒定表明，這6株單克隆抗體均能夠特異地識別NSP1蛋白，能夠識別感染MARC-145細胞和豬肺泡巨噬細胞（PAM）的美洲型PRRSV，并產(chǎn)生特異性的熒光，而單抗1H7、3C7和4H2不能特異性識別

6、感染PAM細胞的歐洲型PRRSV，該研究為NSP1抗原表位鑒定和PRRS診斷奠定了基礎。
　　 2.豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP1非結(jié)構(gòu)蛋白B細胞表位的鑒定
　　 設計36個截短NSP1基因片段，以pET-32a-NSP1為模板，通過PCR擴增所有片段，克隆至pET-32a載體中。利用大腸桿菌BL21誘導表達36個重組截短NSP1蛋白。通過間接ELISA和Western blot方法精確定位單克隆抗體所識別的表位，結(jié)果為

7、:單抗4H2能夠識別NSP1α的E(54) EPLRW(59)，單抗2G5、3E11和4D4識別NSP1α的H(157)VLTNLP(163)。單抗3C7和1H7識別NSP1β蛋白的185aa-232aa位點，該表位為不連續(xù)性表位。為了進一步證明所鑒定的表位是否準確，合成2個肽段(SP)E(54)EPLRW(59)和H(157)VLTNLP(163)，采用Pepscan的方法分析發(fā)現(xiàn)，單抗4H2能夠識別肽段E(54)EPLRW(59)，

8、單抗2G5、3E11和4D4能夠識別肽段H(157)VLTNLP(163)。鑒定的3個NSP1表位均能夠與PRRSV陽性血清反應，但免疫反應較弱。不同PRRSV毒株序列分析發(fā)現(xiàn)，表位E(54)EPLRW(59)在15株北美型PRRSV中高度保守，而與歐洲型毒株相比變異較大;表位H(157) VLTNLP(163)在19株PRRSV中均高度保守，在歐洲型毒株中僅有一個氨基酸的變異(L162→S162);表位185-232aa在美洲型毒株中

9、相對保守，與歐洲型毒株相比變異較大。以上結(jié)果豐富了PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1抗原表位圖譜，為進一步研究NSP1蛋白相關功能奠定了基礎。
　　 3.豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF3-7結(jié)構(gòu)蛋白T細胞表位的解析
　　 本研究通過生物信息學預測該病毒GP3、GP4、GP5、M和N結(jié)構(gòu)蛋白上可能的T細胞表位，合成24條9個氨基酸多肽。同時，利用24頭清潔級仔豬接種PRRSVSY0608毒株，于接種后42和63 d采血分離外周血淋

10、巴細胞體外培養(yǎng)，并用上述多肽進行刺激，通過ELISPOT試驗檢測多肽刺激后特異性IFN-γ的分泌量，結(jié)果為:24條多肽中有7條多肽可以刺激PBMC細胞產(chǎn)生IFN-γ，證明其為T細胞表位，分別位于GP3蛋白的106-114aa(GP3-3)、GP4蛋白的8-16aa(GP4-3)、GP5蛋白的119-127aa(GP5-1)和151-159aa(GP5-2)、M蛋白的43-51aa(M-1)和106-116aa（M-2），N蛋白的25-3

11、3aa(N-1)，其中，4個表位為首次發(fā)現(xiàn)。將表位序列在不同毒株的PRRSV序列中進行比對，發(fā)現(xiàn)GP3-3、M-1、M-4和N-1在美洲型毒株中完全保守，GP4-3、GP5-1和GP5-2在不同美洲型毒株中存在1-4個氨基酸的變異。本研究鑒定的T細胞表位為設計開發(fā)新型抗PRRSV疫苗奠定了基礎。
　　 4.PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白B\T細胞表位基因疫苗抗原分子設計與免疫特性研究
　　 根據(jù)GP3、GP4、GP5和M結(jié)構(gòu)蛋白B細

12、胞表位富集區(qū)和T細胞表位基因序列，設計兩種基因組合的DNA分子，不同表位之間插入柔性氨基酸，基因序列按照豬源偏嗜性密碼子進行優(yōu)化處理。利用真核表達載體pVAX1，構(gòu)建重組真核質(zhì)粒pVAX1-SynBT1、pVAX1-SynBT2、pVAX1-SynB和pVAX1-SynT，Western Blot試驗結(jié)果證明pVAX1-SynBT1、pVAX1-SynBT2、pVAX1-SynB表達蛋白具有PRRSV抗原性。取70只Balb/c小鼠，分

13、為7組，每組10只。第1、2、3、4、5和6組分別腿部肌肉注射免疫pVAX1-SynBT1、pVAX1-SynBT2、pVAX1-SynB、pVAX1-SynT、pVAX1-SynGP5/GP4-5和pVAX1質(zhì)粒DNA，劑量為每只小鼠免疫100μg，第7組為陰性對照組，注射PBS。首免后21、42 d分別以相同的劑量加強免疫。首次免疫后42和63 d采血測定PRRSV特異性ELISA抗體和中和抗體，同時，取脾臟分離淋巴細胞測定淋巴細胞

14、增殖反應，并測定脾臟淋巴細胞體外刺激后細胞因子應答，結(jié)果為:首免后9周pVAX1-SynBT1、 pVAX1-SynBT2和pVAX1-SynGP5/GP4-5免疫組小鼠均能夠產(chǎn)生PRRSV特異性抗體以及細胞免疫應答。其中，pVAX1-SynBT2免疫組的PRRSV特異性ELISA抗體和中和抗體水平明顯高于其它組，其PRRSV抗原刺激產(chǎn)生的IL-4及IFN-γ細胞因子應答均顯著高于其它各免疫組。該研究結(jié)果表明，SynBT2重組質(zhì)粒DNA