豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染Marc-145細胞的膜泡運輸機制的研究.pdf

1、PRRSV是正鏈帶囊膜的RNA病毒，PRRSV感染先與易感細胞表面硫酸乙酞肝素結合發(fā)生吸附，隨后與唾液酸粘附素的結合引發(fā)網(wǎng)格蛋白介導內(nèi)化進入細胞形成內(nèi)體小泡。內(nèi)化進入細胞后PRRSV需要解聚將其基因組釋放并進入細胞漿才能產(chǎn)生感染性病毒粒子。在此過程中除了清道夫受體CD163和pH的降低等因素外，一些蛋白酶活性的分子也是PRRSV感染侵入所必須的。然而相對于PRRSV的吸附內(nèi)吞過程，PRRSV借助何種膜泡運輸機制最終突破囊膜屏障釋放其基因

2、組進入細胞漿還一無所知。目前大多數(shù)病毒，包括PRRSV，在感染宿主細胞的過程中是通過特異性的吸附在細胞表面而被細胞以“主動胞飲”的方式內(nèi)吞，然后進入細胞內(nèi)主要分選站早期內(nèi)含體，之后走向經(jīng)典的內(nèi)吞-溶酶體途徑，或循環(huán)內(nèi)含體膜泡轉運途徑。然而許多病毒在進入內(nèi)吞-溶酶體死亡途徑前在內(nèi)膜系統(tǒng)中pH、離子濃度等因素作用下引發(fā)病毒穿刺進入細胞漿產(chǎn)生感染性病毒粒子。
　　 Rab蛋白是介導細胞內(nèi)膜泡運輸?shù)木哂蠫TP酶活性的開關分子，同時也是作

3、為各內(nèi)含體膜泡的標志性蛋白，已廣泛用于定位細胞內(nèi)各種內(nèi)含體膜泡的研究，如Rab5定位早期內(nèi)含體、Rab7定位晚期內(nèi)含體、Rab11定位近核循環(huán)內(nèi)含體。因此我們以Rab蛋白與PRRSV的共定位實驗結合Rab蛋白負調控突變體對PRRSV感染的抑制試驗確定PRRSV內(nèi)吞后膜泡運輸途徑，DsRED-Rab5/7/11與PRRSV的共定位實驗結果顯示PRRSV能與Rab5/7共定位，另外Rab5/7蛋白負調控突變體實驗也顯示Rab5/7負調控突變

4、體能明顯抑制PRRSV感染，抑制效果分別為70％、30％-80％,因此PRRSV感染依賴于早期內(nèi)含體和晚期內(nèi)含體的膜泡運輸，而近核循環(huán)內(nèi)含體膜泡運輸與PRRSV感染無關。
　　 另外與囊泡運輸相關的PI3K途徑（磷脂酰肌醇激酶途徑），通過與Rab5互作共同調節(jié)早期內(nèi)含體的膜泡運輸與融合，為了更好的解析PRRSV感染過程中的早期內(nèi)含體膜泡運輸過程，我們以PI3K的抑制劑LY294002干擾細胞早期內(nèi)含體膜泡運輸過程來確定其在PRR

5、SV感染中的作用，結果表明LY294002對PRRSV在Marc-145中的感染無明顯抑制作用，因此PRRSV的感染可能通過不依賴于PI3K的非經(jīng)典早期內(nèi)含體膜泡運輸途徑介導。
　　 PKC是另一與囊泡運輸相關的信號分子，與Rab11共同調節(jié)近核循環(huán)內(nèi)含體的運輸。同樣為了更好的解析PRRSV感染與近核循環(huán)內(nèi)含體膜泡運輸?shù)年P系，我們以PKC的抑制劑bisindolylmaleimide(BIM)I干擾細胞近核循環(huán)內(nèi)含體膜泡運輸過程