豬Ⅱ型圓環(huán)病毒感染性克隆的構建及其ORF1的克隆表達.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcine circoviru，PCV)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小動物病毒之一，分為兩型：PCV1和PCV2，二者都屬于圓環(huán)病毒屬。PCV2被認為是豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的病原，而PMWS給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，因此PCV2成為研究的熱點。本研究從具有PMWS臨床及病理變化的淋巴結中克隆得到PCV2的全基因組序列，構建

2、了PCV2突變體的感染性克??；同時，本研究還克隆了PCV2 ORF1基因，并在E．coli中成功表達。 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的PCV2全基因序列，設計一對特異性引物，用PCR方法直接從病料中擴增出PCV2的全基因組序列，將擴增片段克隆于pGEM-T easy載體進行測序，結果表明PCV2基因組全長為176Tbp，命名為ZHEJIANG2006(GenBank登錄號EF210106)。應用DNAstar序列分析軟件分析結果表

3、明，本研究的PCV2序列與國內(nèi)外其它研究中的PCV2序列密切相關，核苷酸序列同源性達95.1％-99.1％，其中ORFI和ORF2所編碼的氨基酸序列與國內(nèi)外其它研究中的PCV2序列比較，同源性也很高，分別為96.2％-99.7％和91.0％-98.7％。 利用重疊延伸法將PCV2 ZHEJIANG2006序列中1162位T→G，1164位C→T，使其ORF2編碼的氨基酸第191位Gly→ser。突變后的全序列克隆入pBluesc

4、ript Ⅱ SK(+)的SacI酶切位點中，構建成重組質(zhì)粒pSK-PCV2(突)。其后從大量擴增的pSK-PCV2(突)酶切得到1767bp的PCV2(突)全長，體外連接環(huán)化后，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染PK-15細胞，并且同時轉(zhuǎn)染pSK-PCV2(突)做為陰性對照。經(jīng)多次傳代后，用間接免疫熒光試驗(IFA)證實環(huán)化的PCV2(突)基因組在細胞內(nèi)能夠表達。 設計特異性引物擴增PCV2上長945bp的ORF1序列，并將其克隆入原核表達載體p