豬腦心肌炎病毒感染性cDNA克隆的構(gòu)建及病毒拯救.pdf

1、豬腦心肌炎是由腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)引起的一種病毒性疾病，臨床癥狀以腦炎、心肌炎和母豬繁殖障礙為主，仔豬感染后致死率較高。本研究利用反向遺傳操作技術(shù)成功構(gòu)建了豬腦心肌炎病毒分離株BD2的全長感染性cDNA克隆，并在編碼先導(dǎo)蛋白的基因中插入外源基因，構(gòu)建出重組病毒，以期為深入研究EMCV的分子致病性與免疫機理、基因功能和新型病毒載體的構(gòu)建及其新型疫苗的研制提供了技術(shù)平臺。
　　

2、根據(jù)EMCV BD2全基因組序列，設(shè)計三對覆蓋病毒全基因組的重疊引物擴增三個片段，然后將其依次連接至已改造的低拷貝質(zhì)粒pWSK29s，構(gòu)建出BD2全長cDNA克隆(pWSKBD2)。經(jīng)測序顯示，該全長質(zhì)粒5'端成功引入了SP6原核啟動子，5'-UTR的poly(C)長度為31nt，3'-UTR的poly(A)長度為18 nt。pWSKBD2全長質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ酶切線化、體外轉(zhuǎn)錄，得到具有感染性的EMCV RNA，經(jīng)脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染BH

3、K-21細胞，24h后出現(xiàn)典型的細胞病變(CPE)，收集培養(yǎng)上清，連續(xù)傳至5代后，經(jīng)RT-PCR和間接免疫熒光鑒定，證實獲得具有感染性的拯救病毒，命名RvEMCV/BD2。第5代拯救病毒TCID50達到108/mL。一步生長曲線顯示，拯救病毒RvEMCV/BD2在BHK-21細胞上的增殖特點與親本毒株BD2差異不顯著。
　　豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)的ORF2基因編碼核衣殼蛋白（C

4、ap蛋白），該蛋白含有病毒主要抗原表位，是研究PCV2基因工程苗的主要候選目的基因?；跇?gòu)建好的EMCV感染性克隆全長質(zhì)粒，采用融合PCR技術(shù)，在編碼病毒先導(dǎo)蛋白的L基因中插入豬圓環(huán)病毒的ORF2基因，構(gòu)建出重組病毒，經(jīng)酶切線化、體外轉(zhuǎn)錄，獲得具有感染性的重組病毒，將其命名為RvEMCV/BD2-ORF2。結(jié)果表明該重組拯救病毒可在BHK-21細胞上穩(wěn)定增殖并穩(wěn)定攜帶外源基因，增殖動態(tài)分析表明，重組拯救病毒與BD2全長cDNA感染性克隆