豬溫兔化弱毒標記株感染性克隆的構建與病毒拯救.pdf

1、豬瘟(Classic Swine Fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classic Swine Fever virus,CSFV)引起的一種豬的高度接觸性傳染疾病,被世界動物衛(wèi)生組織(Office International des Epizoofies,OIE)列為必須通報傳染病之一。豬瘟的流行給世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和貿易造成了巨大損失。豬瘟兔化弱毒疫苗(hog cholera lapinized vurus.HCLV)從1957年就在國

2、內廣泛應用于豬瘟的預防(Zhou TC,1980)。不僅為我國,而且還為歐洲國家CSF控制作出了重大貢獻,是世界公認的金標準弱毒疫苗。但由于疫苗接種豬與自然感染豬不能從血清學上予以區(qū)分,不利于豬瘟的凈化和消滅,研制標記疫苗有助于解決這個問題。
　　 本研究運用反向遺傳操作技術,在實驗室已構建的C株感染性克隆的基礎上,在E1的C末端插入FLAG基因作為標記分子,構建含有FLAG基因的豬瘟兔化弱毒標記毒株vC-FLAG的感染性克隆,

3、并成功拯救出含有FLAG標記的vC-FLAG病毒,并采用豬瘟E2單克隆抗體WH303,FLAG單克隆抗體免疫組化染色,RT-PCR、熒光定量PCR等方法鑒定拯救病毒為vC-FLAG病毒。通過病毒的細胞適應性實驗,證明vC-FLAG病毒可以適應多種豬源細胞,其中以SK6細胞為最佳。通過常規(guī)病毒傳代、細胞帶毒傳代以及帶毒細胞混合正常細胞培養(yǎng)等方法研究標記病毒的傳代方式,使用豬瘟病毒抗原檢測ELISA以及傳代病毒滴度測定,探索病毒增殖的最佳條

4、件。證明了SK6細胞系是培養(yǎng)vC-FLAG的最適細胞系,探索出了使用帶毒細胞混合正常細胞進行傳毒的病毒傳代方法。不同代次病毒經(jīng)免疫組化、RT-PCR和核苷酸序列測定證明嵌合病毒能穩(wěn)定表達標記抗原,且在細胞中傳代的遺傳穩(wěn)定性良好。
　　 通過兔體實驗,研究了豬瘟兔化弱毒標記毒株與兔體反應熱的關系,以及兔豬瘟抗體的消長情況。vC-FLAG保持了與C株兔組織毒一樣的能夠引起典型的兔體反應熱的特性。并且兩株病毒引起的兔血清豬瘟抗體增長規(guī)

5、律一致。vC-FLAG在兔體上連續(xù)傳四代,經(jīng)RT-PCR測序證明該毒株在兔體上的遺傳穩(wěn)定性良好。
　　 為探索研究FLAG抗體的檢測方法,分別采用FLAG的合成肽,FLAG-BAP融合蛋白包被ELISA反應板,首先使用FLAG單克隆抗體建立間接ELISA檢測方法。比較發(fā)現(xiàn)FLAG-BAP蛋白包被的ELISA反應板更加靈敏。于是采用FLAG-BAP包被ELISA反應板進行兔血清抗體的檢測,在接種vC-FLAG和C株第21天的兔血清

6、中FLAG抗體水平并沒有太大的差別。隨后使用商品化兔抗FLAG多克隆抗體進行驗證,發(fā)現(xiàn)該方法對于檢測兔抗FLAG抗體并沒有明顯的特異性。實驗結果表明,標記抗體檢測方法尚不成熟,但為進一步研究標記抗體檢測方法提供了重要數(shù)據(jù)。
　　 綜合上述結果表明,vC-FLAG標記嵌合毒株,可以很好的展示FLAG抗原肽,并且可采取感染細胞混合正常細胞培養(yǎng)的方式進行大量繁殖,在細胞和兔體上傳代遺傳穩(wěn)定。vC-FLAG保持著C株在兔體上引起典型兔體