豬偽狂犬病毒Fa株感染性細菌人工染色體克隆的構建及體外生長特性研究.pdf

1、偽狂犬?。≒seudorabies,PR）又稱 Aujeszky氏病，是由皰疹病毒科（Herpesviridae）α皰疹病毒亞科（Alpha-herpesririnae）引起的多種動物的一種以發(fā)熱、奇癢（豬除外）、繁殖障礙、神經(jīng)癥狀（腦脊髓炎）為主要臨床癥狀的高度致死性、急性傳染病。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其歸為二類動物傳染病，是典型的極難防疫的自然異源性疾病，給全球畜牧業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失。豬偽狂犬病毒（Pseudorabies

2、 virus，PRV）是豬偽狂犬病的病原，其基因組為雙股線性DNA，全長為150kb左右，有70-100種編碼蛋白質，成熟的病毒粒子約含有50種蛋白質。
　　長期以來，研究皰疹病毒基因功能的主要方法是通過構建基因缺失突變株來實現(xiàn)的，但傳統(tǒng)的同源重組使構建工作非常繁瑣，得到的突變株遺傳穩(wěn)定性差，使皰疹病毒的研究受到了限制。自從1999年，美國學者Gregoory等［1］成功構建了偽狂犬病毒的全長感染性克隆以來，對皰疹病毒基因結構和功

3、能的研究起到了巨大的推動作用，并為皰疹病毒作為高效載體系統(tǒng)的開發(fā)提供了嶄新的途徑。
　　本研究根據(jù)PRV Fa株的部分TK基因以及兩側的UL22、UL24基因擴增含有兩個Loxp位點的左、右同源臂，將獲得的左、右同源臂Fa TKA和Fa TKB替換本實驗室已經(jīng)構建好的轉移載體pUC-TKA2-GFP-gpt-TKB（PRV流行毒株）中的TKA2和TKB，獲得PRV Fa株的中間轉移載體pUC-Fa TKAM-GFP-gpt-Fa

4、TKB,然后將pBeloBAC11載體線性化后插入到pUC-Fa TKAM-GFP-gpt-Fa TKB中構建了重組病毒轉移載體pUC- Fa TKAM-GFP-gpt-Fa TKB-BAC。將PRV Fa基因組DNA與重組病毒轉移載體共轉染Vero細胞，經(jīng)過3輪gpt加壓篩選和4輪噬斑篩選得到了純化的帶BAC質粒的重組偽狂犬病毒rPRV-Fa-BAC。將純化的重組病毒 rPRV-Fa-BAC感染Vero細胞，適時提取環(huán)狀的重組病毒基因

5、組DNA，電轉化DH10B感受態(tài)細胞，通過BamHⅠ酶切鑒定篩選BAC分子化克隆，將陽性BAC克隆轉染Vero細胞得到拯救的重組病毒vPRV-BAC-Fa。重組病毒vPRV-BAC-Fa在Vero細胞上盲傳4代后，gpt加壓篩選標記基因和GFP綠色熒光基因仍然存在，通過PCR檢測插入的其它外源片段對以及PRV中的關鍵基因，并選擇部分基因進行序列測定，結果表明拯救的重組偽狂犬病毒vPRV-BAC-Fa得到了穩(wěn)定的遺傳。通過對親本毒PRV