豬偽狂犬病毒GDHD-1株的分離鑒定與致病性研究.pdf

1、豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一種高度接觸性傳染病。該病在全球范圍內(nèi)廣泛分布，可引起種豬繁殖障礙，仔豬呼吸道綜合征、神經(jīng)癥狀、腹瀉、生長(zhǎng)發(fā)育受阻等主要癥狀，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，該病繼續(xù)發(fā)生與流行，推測(cè)新的流行毒株抗原性發(fā)生較大變異，且致病力強(qiáng)，現(xiàn)有的疫苗不能完全保護(hù)流行毒株的感染。因此，為有效防控該病流行，需要研制針對(duì)流行毒株的疫苗。

2、>　　2014年廣東某豬場(chǎng)保育仔豬大量死亡，發(fā)病癥狀與PRV感染相符。本研究對(duì)該豬場(chǎng)PRV野毒株進(jìn)行分離鑒定，并研究其致病性，為研制針對(duì)新流行毒株的疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　1.廣東一株豬偽狂犬病毒的分離鑒定
　　采用PCR、非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞感染、間接免疫熒光、電鏡觀察等方法，從廣東某豬場(chǎng)疑似PRV感染的豬群中分離鑒定病毒。在處理的腦組織病料中PCR擴(kuò)增出PRV野毒株gE基因特異性產(chǎn)物，提示該豬群受PRV野毒感染。將病料

3、上清接種Vero細(xì)胞，36h后細(xì)胞呈現(xiàn)變圓、膨脹、聚集脫落等典型細(xì)胞病變，再經(jīng)PCR檢測(cè)到gE基因特異性產(chǎn)物。將接種病毒的Vero細(xì)胞，用PRV陽(yáng)性血清進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，感染細(xì)胞出現(xiàn)特異性熒光。將病毒液負(fù)染后，在透射電鏡下觀察到直徑為150nm左右病毒顆粒，呈球形，有囊膜，囊膜外有明顯的呈放射狀的纖突，呈現(xiàn)PRV典型的病毒顆粒。將病毒感染Vero細(xì)胞進(jìn)行滴度檢測(cè)，滴度為107.25TCID50/ml。對(duì)病毒gE基因進(jìn)行同源性分析，結(jié)

4、果顯示該分離株與參考毒株gE基因同源性在97.5％～99.9％之間，與我國(guó)2013-2014年間新分離的強(qiáng)毒株具有相近的遺傳進(jìn)化親緣關(guān)系。上述結(jié)果表明，該豬群受PRV野毒感染，并將分離的PRV野毒命名為GDHD-1株。
　　2.豬偽狂犬病毒分離株GDHD-1的致病性研究
　　分別用新西蘭白兔、仔豬分析PRV GDHD-1的致病性。選用6只10周齡健康新西蘭白兔，其中2只皮下注射2ml107TCID50的病毒液，2只皮下注射2

5、ml106TCID50的病毒液，2只對(duì)照組皮下注射2ml無(wú)菌生理鹽水。結(jié)果顯示4只接種PRV GDHD-1的新西蘭白兔在攻毒24h后出現(xiàn)明顯的瘙癢和神經(jīng)癥狀，48～72h后全部死亡，且高滴度病毒攻毒組致死速度明顯快于低滴度病毒攻毒組，證實(shí)PRV GDHD-1對(duì)新西蘭白兔有致死性。
　　將15日齡的新生健康仔豬分成3組，每組5頭。第1組滴鼻接種滴度為107TCID50的病毒液2ml，第2組滴鼻接種滴度為106TCID50的病毒液2m

6、l，第3組作為對(duì)照組滴鼻接種2ml無(wú)菌生理鹽水。接種病毒液的第1組與第2組仔豬表現(xiàn)出高熱、呼吸困難、神經(jīng)癥狀等明顯的偽狂犬病毒感染癥狀，至第10天全部發(fā)病死亡，且高滴度病毒攻毒組致死速度明顯快于低滴度病毒攻毒組;對(duì)照組正常。將15日齡含抗PRV母源抗體的健康仔豬分3組，每組5頭。第1組通過(guò)滴鼻接種滴度為107TCID50的病毒液2ml，第2組通過(guò)滴鼻接種滴度為106TCID50的病毒液2ml;第3組作對(duì)照組通過(guò)滴鼻接種2ml無(wú)菌生理鹽水

7、。接種病毒液的第1組與第2組仔豬均表現(xiàn)出高熱、呼吸困難及神經(jīng)癥狀等偽狂犬病毒感染癥狀，至第11天全部死亡;對(duì)照組正常。另選用8日齡新生健康仔豬分3組，每組5頭。第1組免疫市售國(guó)產(chǎn)PRV弱毒活疫苗2ml，第2組免疫市售進(jìn)口的PRV弱毒活疫苗2ml，對(duì)照組接種等量無(wú)菌生理鹽水;21天后再分別對(duì)第1組和第2組進(jìn)行滴鼻接種滴度為107TCID50的病毒液2ml，對(duì)照組滴鼻接種2ml無(wú)菌生理鹽水。結(jié)果顯示:第1組在攻毒后豬出現(xiàn)高熱、嚴(yán)重呼吸困難、