豬偽狂犬病病毒FZ株的分離鑒定及gD基因的克隆.pdf

1、本試驗(yàn)從福州郊區(qū)某豬場(chǎng)發(fā)生疑似偽狂犬病的仔豬中分離劍一株病毒．進(jìn)行生物學(xué)特性分析，并對(duì)囊膜蛋白gD基因進(jìn)行克隆和序列分析。該毒株初次接種Vero細(xì)胞，第l、2代細(xì)胞病變不明顯，盲傳第3代時(shí)，24h后細(xì)胞開始變圓、集聚成簇、折光度加強(qiáng)，繼而萎縮、脫落、山現(xiàn)空洞，可見合胞體。從第4代開始，16h開始山現(xiàn)典型的細(xì)胞病變。連續(xù)傳15代，均產(chǎn)生典刑的細(xì)胞病變。把適應(yīng)Vero細(xì)胞的病毒液接種MDCK細(xì)胞，可得劍與Vero細(xì)胞相同的細(xì)胞病變，連續(xù)傳2

2、0代，均可產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞病變。試驗(yàn)證實(shí)該病毒具有泛嗜性和融細(xì)胞性，符合皰疹病毒有關(guān)特征。運(yùn)用瓊脂糖固培養(yǎng)基進(jìn)行蝕斑克隆純化病毒，得到了性狀穩(wěn)定的病毒克隆株，并對(duì)克隆株增殖培養(yǎng)作為本試驗(yàn)的種毒進(jìn)一步試驗(yàn)。 該病毒感染MDCK細(xì)胞制作細(xì)胞組織超薄切片，電鏡觀察可見直徑約110-180nm大小不等、不規(guī)則圓形、有囊膜的偽狂犬病毒粒子。該病毒在MDCK細(xì)胞上TCID<,50>為10<'6.601>/0.1ml。用固定病毒稀釋血清法進(jìn)行中

3、和試驗(yàn)，能被豬偽狂犬標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清所中和，其中和效價(jià)為1：77。制作細(xì)胞飛片，8h后經(jīng)偽狂犬標(biāo)準(zhǔn)熒光抗體染色，在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)散在的翠綠色熒光。對(duì)乙醚、熱、胰蛋白酶敏感，在pH5.0-9.0之間保持穩(wěn)定，不凝聚雞、人鼠紅細(xì)胞。感染仔豬癥狀較輕，但在攻毒后25大，可檢測(cè)到偽狂犬的抗體，并在仔豬的肺氣管沖洗液中同收到同樣理化特性的病毒．說(shuō)明仔豬隱性感染或隱性帶毒的存在。接種成兔和小白鼠均可出現(xiàn)典型的偽狂犬病癥狀，具有嗜神經(jīng)性

4、。接種大鼠和雞均不敏感。雞胚尿囊膜方法接種9-12日齡雞胚，86h可見雞胚尿囊膜水腫、出血，有人小不一白色痘斑樣病灶，胚體萎縮，頭蓋部突起、全身彌漫性出血。試驗(yàn)讓實(shí)，本研究所分離的病毒為豬偽狂犬病毒，并命名為PRV FZ株。 根據(jù)GenBanK己發(fā)表的PRV gD基因序列(AJ271966)，設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物，采用病毒感染MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物方法提取病毒基因組DNA作為模板，通過(guò)PcR技術(shù)擴(kuò)增gD基因，成功地?cái)U(kuò)增山1579b

5、p的特異性條帶，其開放閱讀框長(zhǎng)1203bp，共編碼400氨基酸。住gD基因的上、下游引入EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，將同收的gD基因片段克隆到載體PCAGGS，構(gòu)建質(zhì)粒PCA—gD，并轉(zhuǎn)化到大腸桿兇DH5a感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行抗性篩選，得轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR鑒定和艤酶切分析篩選出陽(yáng)性克隆。經(jīng)瓊脂糖電泳試驗(yàn)，成功的克隆到gD基因。通過(guò)對(duì)gD基因測(cè)序結(jié)果的分析，PRV Fz株gD基因與Min A株、Fa株、La株、Kaplan株、Ea株堿