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文檔簡介
1、豬偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的豬的一種以發(fā)熱、腦脊髓炎、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)障礙為主要特征的急性、熱性傳染病。免疫接種基因缺失株的弱毒疫苗是防控偽狂犬病的有效途徑之一。然而,自2011年以來,新的豬偽狂犬病疫情在中國北方的某些豬場最先爆發(fā),盡管這些豬場都免疫過了Bartha-K61株等PRV疫苗,之后疫情逐步向全國大部分養(yǎng)豬場蔓延。研究表明此次疫情是由毒力
2、明顯變強的PRV變異毒株引起的。有研究結(jié)果顯示PRV弱毒疫苗Bartha-K61雖然仍能提供一定的臨床保護,但不能提供足夠的保護力以完全抵御此次流行的毒株,尤其對攻毒后的排毒保護效果很不理想。因此研制出一種針對PRV變異株的新型疫苗是我國養(yǎng)豬業(yè)的緊迫需求。
本研究室從安徽省六安市某豬場的發(fā)病豬中分離了一株豬源偽狂犬病病毒株,該毒株能引起9周齡仔豬發(fā)病死亡,其毒力顯著增強,命名為AH02LA株。進一步以PRV AH02LA株基因
3、組DNA為模板,分別擴增出gE基因兩側(cè)的序列H1、H2作為同源重組臂,以綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)為篩選標(biāo)記,構(gòu)建了GFP轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pPRV-GFP(gE-)。采用磷酸鈣吸附法將pPRV-GFP(gE-) DNA與PRV-AH02LA病毒DNA共轉(zhuǎn)染原代CEF細胞,轉(zhuǎn)染24小時后在紫外光(波長488nm)激發(fā)下觀察細胞病變,挑取發(fā)出綠色熒光的蝕斑,經(jīng)過3~4輪挑斑篩選和傳代,獲得純化的的
4、重組病毒,命名為PRV AH02LA-GFP(gE-)。然后構(gòu)建質(zhì)粒pUC19-(PRVgE-)R,該質(zhì)粒包含完整的gI基因和gE基因ORF的一部分(1299bp-1735bp)以及上下游序列,同樣采用磷酸鈣吸附法將pUC19-(PRV gE-)R DNA與重組病毒PRVAH02LA-GFP(gE-)DNA共轉(zhuǎn)染原代CEF細胞,轉(zhuǎn)染24h后在紫外光(波長488nm)激發(fā)下觀察細胞病變,挑取不發(fā)綠色熒光的蝕斑,經(jīng)過2~3輪挑斑篩選和傳代,
5、獲得純化的偽狂犬病病毒gE單基因缺失株,命名為偽狂犬病病毒LA-A株。
對偽狂犬病病毒gE基因缺失株(LA-A株)的部分生物學(xué)特性進行了鑒定。將PRV LA-A株分別感染CEF和BHK-21細胞,觀察病變情況并繪制PRV LA-A株在CEF和BHK-21細胞的生長動力學(xué)曲線;用TCID50法檢測CEF和BHK-21細胞的病毒效價,結(jié)果顯示,PRV LA-A株在CEF和BHK-21細胞中均能增殖,達到較高的病毒效價,PRV LA
6、-A株感染CEF細胞的病毒效價平均為106.5TCID50/mL,感染BHK-21細胞的病毒效價平均為107.8TCID50/mL。病毒的生長動力學(xué)顯示,PRV LA-A株在CEF和BHK-21細胞上有相似的增殖周期,即在接毒一定時間內(nèi)增殖能力顯著上升,其后增殖平緩,甚至下降;但增殖效價有較大差異;從病毒的體外生長曲線可以看出,gE基因缺失病毒PRV LA-A株和親本病毒AH02LA株具有相似的生長動力學(xué),在36h~48h都達到峰值,滴
7、度最高可達109.5TCID50/mL以上,說明gE基因的缺失對病毒的復(fù)制幾乎沒有影響。
安全性試驗表明偽狂犬病病毒LA-A株對4周齡仔豬安全,且可以通過常規(guī)鑒別診斷方法區(qū)別偽狂犬病病毒LA-A株免疫豬只與自然感染豬只。對偽狂犬病病毒gE基因缺失株(LA-A株)滅活疫苗與偽狂犬活疫苗(Bartha-K61株)進行免疫效力比較研究,免疫攻毒試驗結(jié)果表明免疫Bartha K61株疫苗對免疫組豬僅能產(chǎn)生部分保護,不能阻止發(fā)病和排毒。
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