豬偽狂犬病病毒gE-TK基因缺失株的構(gòu)建及免疫效力的研究.pdf

1、豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的以家畜和多種野生動(dòng)物發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎為特征的急性、熱性傳染病。該病在豬群多呈暴發(fā)流行，給我國乃至全球的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，目前尚無治療PR的有效藥物，因此疫苗接種成為控制該病發(fā)生和流行的主要措施。本研究以實(shí)驗(yàn)室分離株P(guān)RV-JSZ株為材料，通過Cre-loxP系統(tǒng)構(gòu)建了不帶標(biāo)記基因的gE單缺失株及gE/TK雙缺失株

2、，對(duì)重組偽狂犬病病毒的生長特性及免疫保護(hù)力進(jìn)行了初步研究，為研制豬偽狂犬病疫苗及病毒載體疫苗提供了技術(shù)平臺(tái)。
　　 1偽狂犬病毒gE單缺失株及gE/TK雙缺失株的構(gòu)建
　　 以PRV-JSZ株基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增出gE基因、TK基因兩側(cè)的序列作為重組臂，以綠色熒光蛋白EGFP為篩選標(biāo)記，分別構(gòu)建了帶有l(wèi)oxP位點(diǎn)的pSKgERL-GFP、pSKTKRL-GFP轉(zhuǎn)移載體。蛋白酶K消化和苯酚抽提法提取PRV-JSZ株

3、感染的PK15細(xì)胞總DNA，運(yùn)用磷酸鈣沉淀法，將細(xì)胞總DNA和轉(zhuǎn)移載體pSKgERL-GFP以10μg:1μg的量共轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，待出現(xiàn)80％細(xì)胞病變時(shí)收獲病毒，倍比稀釋后接種單層PK15細(xì)胞，以空斑純化法得到帶有EGFP的重組病毒rPRV-gE-/GFP。取10μgrPRV-gE-/GFP基因組DNA，加入2.5單位Cre重組酶，37℃作用1h;抽提DNA，制備磷酸鈣-DNA沉淀物，轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，空斑純化得到剔除EGFP的gE

4、單缺失株rPRV-gE-?；蚪MPCR產(chǎn)物序列分析顯示rPRV-gE-在gE基因內(nèi)部缺失883bp。將rPRV-gE-基因組DNA和轉(zhuǎn)移載體pSKTKRL-GFP共轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，待出現(xiàn)80％細(xì)胞病變時(shí)收獲病毒，熒光篩選得到重組病毒rPRV-gE-/TK-/GFP，將Cre重組酶處理的rPRV-gE-/TK-/GFP基因組DNA轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，篩選獲得了剔除EGFP的gE/TK雙缺失株rPRV-gEˉ/TK-?；蚪MPCR產(chǎn)物序列分

5、析顯示rPRV-gEˉ/TKˉ在TK基因內(nèi)部缺失498bp。
　　 2缺失株生長特性及免疫效力的研究
　　 對(duì)gE單缺失株及gE/TK雙缺失株生長特性及免疫效力的研究發(fā)現(xiàn)，PRV-JSZ、rPRV-gE-和rPRV-gE-/TK-在PK15細(xì)胞上的最高滴度分別為10-4.932TCID50/0.1mL、10-4.944TCID50/0.1mL和10-4.444TCID50/0.1mL，與野生株相比，gE基因的缺失對(duì)病毒增

6、殖無明顯影響，而gE和TK基因的雙缺失對(duì)病毒的增殖有一定影響。PRV-JSZ、rPRV-gE-和rPRV-gE-/TK-對(duì)小鼠的LD50分別為3.16×103TCID50、5.01×104TCID50和＞1×105TCID50，結(jié)果表明，與野生株比較，gE單缺失株對(duì)小鼠的毒力有所降低，gE/TK雙缺失株則表現(xiàn)出毒力的顯著降低。以104TCID50免疫小鼠，利用ELISA方法檢測(cè)血清中的抗PRV抗體，rPRV-gE-/TKˉ免疫組在免疫后