山東省免疫豬場(chǎng)豬偽狂犬病毒分離鑒定及gE、gC、gD和TK基因的序列分析.pdf

1、偽狂犬病(pseudorabies，PR)是由偽狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的多種家畜以及野生動(dòng)物的一種急性致死性傳染病，只有豬可以在急性感染中存活，是該病的自然儲(chǔ)存宿主。豬偽狂犬病是當(dāng)前我國(guó)豬場(chǎng)一種非常重要的病毒性疾病，給感染豬場(chǎng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2011年前由于基因缺失苗的應(yīng)用以及鑒別診斷方法gE-ELISA的配合使用，PR在我國(guó)得到了有效的控制。然而，山東省從2011年開始各地陸續(xù)在疫苗免疫豬場(chǎng)發(fā)

2、生PR，造成母豬流產(chǎn)死胎，哺乳仔豬呈現(xiàn)嘔吐腹瀉及神經(jīng)癥狀，并導(dǎo)致高死亡率。本研究主要分為兩部分:
　　第一部分山東省免疫豬場(chǎng)12株P(guān)RV分離和鑒定
　　2013年12月份至2014年5月，采集山東省濟(jì)南、德州、臨沂、濰坊、東營(yíng)、青島等地12個(gè)經(jīng)PRV疫苗(Bartha-K61)免疫豬場(chǎng)的PR疑似病料，病料研磨處理，過濾除菌后接種到BHK-21細(xì)胞上。連續(xù)在BHK-21細(xì)胞上增殖6代，第五代和第六代細(xì)胞培養(yǎng)液的DNA使用偽狂犬

3、病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，并將第六代的病毒液接種成兔。結(jié)果12份病料的組織勻漿液接種后的BHK細(xì)胞以及之后增殖病毒的每一代細(xì)胞均出現(xiàn)了典型的PRV感染所致的細(xì)胞病變。提取第五代和第六代細(xì)胞培養(yǎng)液的DNA，經(jīng)偽狂犬病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，12株P(guān)RV的第五代和第六代細(xì)胞培養(yǎng)液全部為陽性。12株P(guān)RV第六代病毒液接種成兔后均出現(xiàn)奇癢并最終死亡。TCID50測(cè)定結(jié)果顯示，12株P(guān)RV的TCID50介于10-7.1/0.1ml與10-

4、9.5/0.1ml之間。以上結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)自山東省免疫豬場(chǎng)分離到12株P(guān)RV。
　　第二部分12株P(guān)RV gE、gC、gD和TK基因的序列分析
　　本研究對(duì)2013和2014年從山東省免疫豬場(chǎng)分離到的12株P(guān)RV的gE、gC、gD和TK基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定與分析。結(jié)果顯示，12株P(guān)RV的gE基因核苷酸和氨基酸同源性分別為99.9％～100％和99.7％～100％;與亞洲毒株的核苷酸和氨基酸同源性均高于歐美毒株。gE

5、基因的氨基酸進(jìn)化樹分析表明，包括本研究分離的12株P(guān)RV在內(nèi)的所有42株亞洲毒株屬于GⅠ型，所有歐美毒株屬于GⅡ型。這兩個(gè)基因型之間分別在第58、105、148、178、180、214、215、470、500、505、518、522和569位存在明顯的氨基酸差異，可以作為鑒別PRV歐美毒株與亞洲毒株的遺傳標(biāo)志。
　　12株P(guān)RVgC基因的核苷酸和氨基酸同源性分別為99.8％～100％和99.6％～100％。gC基因氨基酸進(jìn)化樹顯示

6、，包括本研究分離的12株P(guān)RV在內(nèi)41株國(guó)內(nèi)外分離株分為3個(gè)基因型:GⅠ型、GⅡ型和GⅢ型。而GⅠ型又分為S1和S2兩個(gè)亞型，除WY、LJN01-2014和SC1301的國(guó)內(nèi)2011年后分離株位于S1亞型。
　　12株P(guān)RV的gD基因核苷酸和氨基酸同源性均為99.8％～100％，國(guó)內(nèi)分離株的核苷酸同源性均高于三株歐美毒株。國(guó)內(nèi)毒株與歐美毒株在340位和347位的氨基酸存在穩(wěn)定的突變。gD基因的氨基酸進(jìn)化樹顯示所有的國(guó)內(nèi)分離株與三株