偽狂犬病毒LLT基因miRNA簇的功能研究.pdf

1、偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)屬于水痘病毒屬皰疹病毒科α皰疹病毒亞科成員，是偽狂犬病病原，能感染多種哺乳動(dòng)物引起發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎等癥狀，給家豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。我國是豬肉消費(fèi)大國，偽狂犬病嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。偽狂犬病在國內(nèi)的首次記錄出現(xiàn)于1948年，并在上世紀(jì)八十年代廣泛流行，造成大量懷孕母豬流產(chǎn)，PRV Ea株便是在當(dāng)時(shí)分離得到的。PRV Ea株由于具有高致病性和強(qiáng)免疫原性而被廣泛研究，

2、既可作為表達(dá)其病基因的活病毒載體，也是研究PRV毒株遺傳進(jìn)化關(guān)系的參考毒株，還是作為研究病毒宿主相互作用的模式生物，被認(rèn)為是PRV國內(nèi)參考株。
　　為控制PRV在國內(nèi)的蔓延，匈牙利弱毒疫苗株Bartha在上世紀(jì)60年代被引入中國，同時(shí)隨著Ea株等國內(nèi)毒株的分離、鑒定，多種基于國內(nèi)本土PRV毒株構(gòu)建的基因缺失疫苗也得到大力發(fā)展，在這些弱毒疫苗和基因缺失疫苗的廣泛使用下，PRV在我國的傳播被有效控制。然而自2011年年底之后，偽狂犬病

3、在我國多個(gè)省份疫苗接種過的豬場再次爆發(fā)，分離鑒定得到多株P(guān)RV變異株。為進(jìn)一步了解近年國內(nèi)偽狂犬病再次爆發(fā)的原因，本論文對國內(nèi)參考株Ea與變異株HNX、弱毒疫苗株Bartha的生物學(xué)功能差異進(jìn)行了比較。通過三代測序技術(shù)PacBio結(jié)合二代測序技術(shù)Illumina獲得經(jīng)典株Ea的全基因組序列，進(jìn)化比對分析確認(rèn)了PRV變異株與包括Ea株在內(nèi)的國內(nèi)早期毒株親緣關(guān)系較近，證明變異株是從早期國內(nèi)毒株演變而來，PRV在國內(nèi)的進(jìn)化不依賴國外毒株。Ea

4、株與變異株空斑大小有顯著差異，雖然病毒蛋白質(zhì)氨基酸序列同源性較高，但其病毒粒子組分和感染細(xì)胞后病毒各蛋白表達(dá)量存在差異，蛋白表達(dá)水平的差異可能是造成兩者致病力不同的原因。
　　PRV能在自然宿主體內(nèi)建立終身潛伏感染。在潛伏期，病毒在宿主三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)表達(dá)大量潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄物L(fēng)LT。研究發(fā)現(xiàn)PRV LLT Intron能編碼11個(gè)成簇存在的miRNAs，靶基因預(yù)測結(jié)果顯示這些miRNAs可能參與調(diào)節(jié)病毒與宿主多個(gè)基因的表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)證明

5、PRV LLT miRNA簇與病毒增殖能力和誘導(dǎo)凋亡的能力有關(guān)，參與調(diào)控病毒IE180和EP0蛋白的表達(dá)。但是，關(guān)于PRV LLT miRNA簇在宿主體內(nèi)的功能仍不清楚，為進(jìn)一步探究PRV LLT miRNA簇與病毒毒力的關(guān)系，本研究以PRV感染的天然宿主豬為對象，通過臨床癥狀觀察、鼻眼試子病毒分離、血清學(xué)檢測、三叉神經(jīng)節(jié)病毒拷貝數(shù)檢測等方法比較分析了miRNA簇缺失株與野毒株的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒缺失miRNA簇后引起的臨床癥狀、排毒能

6、力和免疫應(yīng)答水平都有所減弱，證明miRNA簇與病毒毒力有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，LLTmiRNA簇真核表達(dá)質(zhì)粒在體外可不依賴于病毒基因而獨(dú)立編碼miRNAs，且免疫小鼠后能提高小鼠抗病毒能力。由此認(rèn)為，PRV LLT miRNA簇與病毒神經(jīng)毒力和致病力有關(guān)，miRNA簇是病毒的一個(gè)毒力因子。
　　為進(jìn)一步深入研究PRV miRNA簇中各個(gè)miRNA的功能，需要構(gòu)建單個(gè)miRNA突變株?？紤]到通過傳統(tǒng)同源重組方法構(gòu)建病毒突變株較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力