偽狂犬病毒VP22蛋白缺失突變體的構(gòu)建及其功能研究.pdf

1、蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)（Protein transduction）是近年來生命科學(xué)領(lǐng)域的一項具有重要理論意義和潛在應(yīng)用價值的新發(fā)現(xiàn)。具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)特性的蛋白能夠直接作用于脂質(zhì)雙層，以一種不依賴于受體和其它轉(zhuǎn)運蛋白的非經(jīng)典途徑高效穿過生物膜進入細(xì)胞，并能在細(xì)胞間自主高效地傳遞。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白獨特的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力不僅徹底打破了傳統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移模式，而且為增強人類基因治療的效果、提高新型疫苗的免疫效力提供了新的途徑，并成為近年來研究的熱點之一。 繼人單純皰

2、疹病毒（HSV-1）的VP22蛋白被證實具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)特性之后，牛皰疹病毒I型（BHV-1）、馬立克氏病毒I型（MDV-1）以及偽狂犬病毒（PRV）的VP22蛋白也相繼被確定具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)特性，但這4種VP22的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)能力存在差異，相比較而言，BHV-1VP22（BVP22）和PRV VP22（PVP22）的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)能力明顯強于HSV-1VP22（HVP22）和MDV-1VP22（MVP22）。而且本實驗室的研究還發(fā)現(xiàn)，PVP22在轉(zhuǎn)染細(xì)

3、胞中有多種亞細(xì)胞定位形式。這些具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能但轉(zhuǎn)導(dǎo)能力不同蛋白的發(fā)現(xiàn)和深入研究，為了解VP22蛋白結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系、探討VP22蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)生機制提供了新的契機，為設(shè)計和開發(fā)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力更強的新蛋白提供了新材料。 本課題以PVP22這種新發(fā)現(xiàn)的、并且轉(zhuǎn)導(dǎo)能力更強的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白作為研究對象，通過構(gòu)建不同區(qū)段缺失的突變體，分析了這些突變體的亞細(xì)胞定位，比較了各個突變體的轉(zhuǎn)導(dǎo)特性、轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的差異，并探討了這些突變體對DNA疫苗的

4、免疫增強作用與其轉(zhuǎn)導(dǎo)特性之間的關(guān)系，為深入了解PVP22的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)特性和可能的作用機制奠定了基礎(chǔ)，具體研究內(nèi)容如下： 1．通過PCR擴增的方法，獲得了偽狂犬病毒VP22的7個C-端缺失突變體：Pmut1（1-30aa）、Pmut2（1-60aa）、Pmut3（1-90aa）、Pmut4（1-111aa）、Pmut5（1-159aa）、Pmut6（1-187aa）、Pmut7（1-241aa），7個N-端缺失突變體：Pmut8（3

5、1-247aa）、Pmut9（61-247aa）、Pmut10（91-247aa）、Pmut11（112-247aa）、PmutB（149-247aa）、Pmut12（160-247aa）、Pmut16（188-247aa）和八個C-端、N-端同時缺失的突變體：Pmut13（61-148aa）、Pmut14（188-241aa）、Pmut15（160-241aa）、Pmut17（149-187aa）、Pmut18（149-223aa）、

6、Pmut19（149-213aa）、Pmut20（112-187aa）、Pmut83（149-231aa），并且分別構(gòu)建了這些缺失突變體與增強型綠熒光蛋白mut4EGFP融合表達(dá)的真核表達(dá)質(zhì)粒。 2．將上述22個PVP22突變體與增強型綠色熒光蛋白mut4EGFP融合表達(dá)的真核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，通過熒光顯微鏡直接觀察細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光分布，并與野生型PVP22（1-247aa）進行比較，初步確定了與PVP22亞細(xì)胞定位

7、有關(guān)的結(jié)構(gòu)域：1-30aa、60-90aa、112-149aa、187-247aa這4個片斷均與PVP22核定位功能有關(guān)；1-30aa、187-241aa與PVP22微管定位功能有關(guān)；與細(xì)胞核內(nèi)的顆粒樣定位形式有關(guān)的區(qū)域在第111-159個氨基酸之間，并且第1-30個氨基酸對這種定位形式有著增強作用；發(fā)現(xiàn)兩種野生型PVP22所沒有的定位形式：一種是在細(xì)胞核周圍聚集，與這種定位形式有關(guān)的區(qū)域位于第187-241個氨基酸之間，而第149-1

8、60個氨基酸的存在對這種定位形式有阻礙作用；另一種是細(xì)胞漿內(nèi)的斑點樣定位，與這種定位有關(guān)的區(qū)域位于第149-223個氨基酸之間，第224-231個氨基酸的存在阻礙著該定位形式的出現(xiàn)。 3．進一步分析了上述22個突變體在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)Pmut7（1-241aa）、Pmut8（31-247aa）、Pmut9（31-247aa）、Pmut10（31-247aa）、Pmut11（31-247aa）這五個突變體均具有明顯的

9、蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象，Pmut6（1-187aa）、Pmut83（149-241aa）、PmutB（149-247aa）的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)能力雖然有所下降，但仍具有轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，從而初步確定了與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的功能域位于第149-231個氨基酸之間。 4．將上述缺失突變體與mut4EGFP融合表達(dá)的真核表達(dá)質(zhì)粒分別免疫Balb／c小鼠，用大腸桿菌表達(dá)并經(jīng)幾丁質(zhì)試劑盒純化的mut4EGFP作為ELISA抗原，通過DNA疫苗免疫的方式間接評價不同突變體在

10、體內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)能力以及增強DNA疫苗免疫效果的差異，發(fā)現(xiàn)Pmut6（1-187aa）、Pmut7（1-241aa）、Pmut8（31-247aa）、Pmut9（61-247aa）、Pmut10（91-247aa）、Pmut11（112-247aa）、Pmut83（149-241aa）、PmutB（149-247aa）分別與mut4EGFP融合能顯著增強mut4EGFP特異性ELISA抗體，但不同突變體的增強程度存在差異：其中Pmut7、

11、Pmut8、Pmut9、Pmut10、Pmut11這5個突變體，與pcEGFP、pcDNA3.1+對照組相比，能顯著增強mut4EGFP特異性的體液免疫反應(yīng)（P<0.01），但與野生型的PVP22免疫組相比，抗體水平的差異并不顯著（P>0.05）；Pmut6、Pmut83、PmutB免疫組與pcEGFP、pcDNA3.1+免疫組相比也能增強mut4EGFP特異性的體液免疫反應(yīng)（P<0.05），但增強水平低于Pmut7、Pmut8、Pmu