偽狂犬病毒編碼的microRNAs功能研究.pdf

1、偽狂犬病毒(PRV)是α皰疹病毒亞科的重要成員之一，具有嗜神經(jīng)性和潛伏感染性，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。在偽狂犬病毒的急性感染期或者裂解感染期，被膜蛋白VP16通過與宿主的細胞因子Oct-1和HCF-1結合從而激活立即早期基因IE180的轉錄和表達，進而調(diào)控一系列下游基因的表達和病毒的增殖。主要組織相容性復合體Ⅰ類分子(MHCⅠ)可以識別和遞呈病毒編碼的內(nèi)源性蛋白，發(fā)揮抗病毒免疫作用。
　　病毒編碼的microRNA(miRNA

2、)在病毒生命周期中參與調(diào)控病毒基因的表達和病毒的增殖，也可以調(diào)控宿主細胞的凋亡、代謝和免疫。先前，我們實驗室報道了PRV的長潛伏感染相關基因(LLT)可以編碼11個成熟的miRNAs，但是這些miRNAs的具體功能還不清楚。本研究選擇了病毒復制關鍵基因和宿主免疫識別基因作為研究對象，希望通過發(fā)掘作用于這些重要基因的miRNA，加深對病毒致病機理的認識，為開發(fā)新的疫苗或藥物提供理論指導。具體研究內(nèi)容如下:
　　1.通過生物信息學軟件

3、預測篩選到prv-mir-LLT7既可以結合MHCⅠ基因的3'UTR又可以結合PRV的VP16基因的3'UTR，其中prv-mir-LLT7在VP16的3'UTR中有2個作用位點;預測篩選到PRV編碼的prv-mir-LLT1、prv-mir-LLT7、prv-mir-LLT8、prv-mir-LLT9和prv-mir-LLT11等5個miRNRs可以作用于IE180基因。
　　2.為了驗證MHCⅠ基因和VP16基因是否被prv-

4、mir-LLT7直接調(diào)控和確定prv-mir-LLT7作用MHCⅠ基因和VP16基因的位點，本研究使用雙熒光素報告實驗證實了prv-mir-LLT7既可以作用于MHCⅠ基因又可以作用于VP16基因，其中prv-mir-LLT7在VP16的3'UTR中有2個作用位點。通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和流式細胞檢測實驗，發(fā)現(xiàn)prv-mir-LLT7可以下調(diào)MHCⅠ基因的轉錄和翻譯。通過qRT-PCR和western blot實驗，發(fā)

5、現(xiàn)prv-mir-LLT7可以下調(diào)VP16的轉錄和翻譯;隨后進一步檢測發(fā)現(xiàn)prv-mir-LLT7還能夠下調(diào)IE180的轉錄和翻譯;通過miRNA inhibitor抑制prv-mir-LLT7后，qRT-PCR和western blot實驗結果表明prv-mir-LLT7 inhibitor可以抑制prv-mir-LLT7對MHCⅠ和VP16基因的調(diào)控。
　　3.我們使用qRT-PCR方法檢測PRV感染上皮細胞后的prv-mir

6、-LLT7的表達譜，分析了prv-mir-LLT7的表達與prv-mir-LLT7作用于MHCⅠ和VP16的相關性。通過一步生長曲線實驗，結果顯示prv-mir-LLT7在細胞感染PRV后9h時候可以降低PRV增殖。
　　4.為了驗證病毒編碼的5個miRNAs是否直接作用IE180基因，本研究使用雙熒光素酶報告實驗。點突變實驗和劑量依賴實驗實驗結果顯示PRV編碼的prv-mir-LLT1、prv-mir-LLT9和prv-mir-

7、LLT11可以直接作用于IE180基因。通過western blot實驗，發(fā)現(xiàn)PRV編碼的prv-mir-LLT1、prv-mir-LLT9和prv-mir-LLT11下調(diào)IE180的表達。
　　綜上所述，PRV編碼的prv-mir-LLT7可以調(diào)控豬的MHCⅠ基因和病毒的VP16基因的表達。該病毒編碼的prv-mir-LLT1、prv-mir-LLT9和prv-mir-LLT11可以下調(diào)IE180基因的表達。我們推測α皰疹病毒進