偽狂犬病毒IE180和EPO基因的表達(dá)調(diào)控.pdf

1、偽狂犬病毒（Pesudorabies virus，PRV）是皰疹病毒科α皰疹病毒亞科的一員，能夠引起多種家畜和野生動(dòng)物的偽狂犬病，豬為該病毒的貯存宿主。偽狂犬病在豬群中的爆發(fā)和流行給全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，雖然個(gè)別國(guó)家在該病的根除上已經(jīng)取得了一定的成效，但在許多其它國(guó)家和地區(qū)仍然呈地方性流行，所以在養(yǎng)豬業(yè)上偽狂犬病仍然是疾病控制的一個(gè)重點(diǎn)。PRV和所有的其它皰疹病毒一樣，基因組的表達(dá)呈級(jí)聯(lián)方式調(diào)節(jié)，生命周期中都經(jīng)歷一個(gè)潛伏感

2、染時(shí)期。許多皰疹病毒都編碼幾個(gè)立即早期基因和更多的早期基因，然而PRV只有一個(gè)立即早期基因IE180，已經(jīng)報(bào)道的早期基因只有EP0、TK和UL54三個(gè)。另外，雖然PRV的宿主譜很廣，而且和人的一些皰疹病毒同源性很高，但是對(duì)人類并不敏感，所以它逐漸被病毒學(xué)家們用做一個(gè)研究皰疹病毒分子生物學(xué)的模式生物。
　　 本研究通過(guò)對(duì)PRV的立即早期基因IE180和早期基因EP0的調(diào)控功能的研究，驗(yàn)證了IE180基因?qū)P0基因和TK基因的正調(diào)

3、控作用；研究了IE180基因和EP0基因的自調(diào)控；發(fā)現(xiàn)了PRVEa株和Fa株的EP0基因（EP0/Ea、EP0/Fa）對(duì)IE180基因和TK基因的負(fù)調(diào)控作用；探討了EP0中特定氨基酸的改變對(duì)其調(diào)控功能的影響；初步把EP0的負(fù)調(diào)控必需功能域定位在環(huán)指結(jié)構(gòu)域部位。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1．PRV Ea株IE180、EP0和TK三個(gè)基因啟動(dòng)子的克隆及活性驗(yàn)證
　　 通過(guò)PCR擴(kuò)增的方法從PRV Ea株基因組DNA中克隆了I

4、E180、EP0和TK三個(gè)基因的啟動(dòng)子序列，并進(jìn)行了序列測(cè)定。用這些啟動(dòng)子序列分別置換本研究中所構(gòu)建的兩個(gè)報(bào)告基因質(zhì)粒（pcDNA-EGFP，pcDNA-lacZ）的CMV啟動(dòng)子，以驗(yàn)證啟動(dòng)子活性。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明所克隆的三個(gè)基因的啟動(dòng)子序列均具有啟動(dòng)子活性，可以在沒(méi)有病毒任何其它基因表達(dá)的情況下啟動(dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。
　　 2．IE180基因?qū)P0、TK基因的轉(zhuǎn)錄激活
　　 IE180基因增強(qiáng)TK基因的表達(dá)已經(jīng)得到了證

5、實(shí)，但是對(duì)EP0基因的調(diào)控尚無(wú)報(bào)道。本研究通過(guò)IE180基因的真核表達(dá)質(zhì)粒與EP0或TK基因啟動(dòng)子的報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IE180基因的表達(dá)確實(shí)能夠顯著增強(qiáng)EP0基因和TK基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，符合預(yù)期結(jié)果。
　　 3．IE180基因和EP0基因的自調(diào)控
　　 以前的研究證實(shí)PRV Ka株IE180基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)能夠抑制自身啟動(dòng)子的活性，表現(xiàn)出一種負(fù)的自調(diào)控機(jī)制。本研究在用PRV Ea株IE180基因啟動(dòng)子的

6、報(bào)告基因質(zhì)粒和IE180基因真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)Ea株的IE180基因也同樣具有負(fù)的自調(diào)控現(xiàn)象。另外本研究發(fā)現(xiàn)PRV Ea株的早期基因EP0在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中也顯著抑制了其自身啟動(dòng)子的活性，表現(xiàn)出對(duì)自身的負(fù)調(diào)控現(xiàn)象，之前對(duì)PRV的研究中尚沒(méi)有類似的報(bào)道。
　　 4．PRVFa株EP0基因的克隆及序列分析
　　 通過(guò)PCR擴(kuò)增的方法從PRV Fa株基因組DNA中克隆了完整的EP0基因，并進(jìn)行了序列測(cè)定。將推導(dǎo)出的的PR

7、V Fa株EP0氨基酸序列與Ea株的EP0序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)它們均編碼409個(gè)氨基酸。相對(duì)于日本分離株YS-81株的EP0（EP0/YS-81）而言，它們都在相同的位置缺失了一個(gè)氨基酸，而且存在6個(gè)相同的氨基酸突變，但是EP0/Ea比EP0/Fa又多出了3個(gè)氨基酸的突變。
　　 5．EP0/Ea和EP0/Fa對(duì)IE180、TK基因的負(fù)調(diào)控
　　 實(shí)驗(yàn)初期，在用PRV Ea株EP0基因的真核表達(dá)質(zhì)粒分別與IE180和TK基

8、因啟動(dòng)子的報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)Ea株EP0的表達(dá)能夠顯著抑制正180和TK基因的啟動(dòng)子的活性，表現(xiàn)為一種負(fù)調(diào)控。為了驗(yàn)證PRV Fa株的EP0是否也具有同樣的功能，克隆了PRV Fa株EP0的全基因序列。隨后的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明，PRVFa株的EP0基因的表達(dá)同樣顯著抑制了IEl80和TK基因啟動(dòng)子的活性。
　　 6．EP0/Ea、EP0/Fa的緊接環(huán)指結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)氨基酸的變化對(duì)其調(diào)控功能的影響
　　 根據(jù)對(duì)不同毒

9、株EP0的氨基酸序列分析和疏水性分析，推測(cè)緊接環(huán)指結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)氨基酸的變化可能會(huì)較大的影響EP0的調(diào)控功能。為了證實(shí)這個(gè)推測(cè)，采用DNA合成置換的方法對(duì)EP0/Fa和EP0/Fa基因中的第85、86位氨基酸進(jìn)行回復(fù)突變。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)對(duì)EP0/Fa進(jìn)行回復(fù)突變后，其對(duì)IE180和TK啟動(dòng)子的抑制功能明顯減弱；而在EP0/Fa中，這兩個(gè)氨基酸的改變對(duì)其抑制效應(yīng)并沒(méi)有產(chǎn)生顯著的變化。這些結(jié)果說(shuō)明，EP0中第85、86位氨基酸的改變確實(shí)

10、能夠影響整個(gè)EP0的調(diào)控功能。
　　 7．PRV Ea株和Fa株EP0基因的功能域定位
　　 采用PCR擴(kuò)增的方法構(gòu)建了EP0/Fa、EP0/Fa的不同區(qū)段的缺失突變體，進(jìn)一步構(gòu)建對(duì)應(yīng)的真核表達(dá)質(zhì)粒。將這些突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒分別與IE180和TK基因啟動(dòng)子的報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，做流式分析。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在EP0/Fa和EP0/Fa中環(huán)指結(jié)構(gòu)域的存在和完整對(duì)其發(fā)揮負(fù)調(diào)控功能來(lái)說(shuō)是必需的，另外氨基酸第1-113的突變體

11、表現(xiàn)出顯性隱性的特性。
　　 8．PRV IE180基因特異性siRNA分子的篩選
　　 先后根據(jù)已知的PRV TNL株和在本研究中測(cè)出的Ea株IE180基因序列設(shè)計(jì)合成了5個(gè)siRNA分子，構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒，與IE180-EGFP融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所設(shè)計(jì)的5個(gè)siRNA分子均無(wú)顯著的抑制效果。推測(cè)可能是由于目標(biāo)序列結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性等所造成，靶位點(diǎn)可能被目標(biāo)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)或者高度折疊區(qū)域掩蓋