偽狂犬病毒gB基因在畢赤酵母中的表達及初步應用.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)又稱Aujeszky's病，其病原偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)是皰疹病毒科(Herpes viridae)，α-皰疹病毒亞科(Alpha herpes viridae)的成員，基因組大小約150Kb，G+C含量高達73％，是一種線狀雙鏈DNA病毒。偽狂犬病可引起牛、羊及野生動物的發(fā)熱、奇癢(除豬外)、腦脊髓炎等癥狀，豬是偽狂犬病毒(PRV)的天然宿主和主要感染源。偽

2、狂犬病是世界性的重要傳染病之一，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失，其危害僅次于豬瘟和口蹄疫。經研究發(fā)現(xiàn)，囊膜糖蛋白gB是偽狂犬病毒(PRV)的一個重要免疫原，能介導病毒與細胞間的相互作用，屬于必需糖蛋白，也是皰疹病毒中最為保守的基因。gB糖蛋白作為動物機體免疫系統(tǒng)識別的主要靶抗原，在偽狂犬病診斷和根除計劃中發(fā)揮著重要的作用。
　　 本研究選擇偽狂犬病毒gB糖蛋白作為研究對象，利用DNAMAN和Oligo6.3軟件對Geneban

3、k中登錄的各偽狂犬病毒(PRV)gB基因序列進行分析，分別設計合成了3對特異性引物：一對不含酶切位點引物、一對熒光特異性引物和TaqMan探針、一對含有EcoRI和XbaI酶切位點引物。
　　 1、通過DNA/RNA提取試劑盒對PRV病毒進行DNA的提取，利用普通PCR技術獲得了全長約2.8Kb的PRV-gB基因，并克隆至pMD20-T載體，成功構建了重組質粒pMD20-gB。通過基因測序和Genebank分析其生物學特性，最終

4、鑒定本實驗室所分離PRV毒株為南陽株(Namyangju)。
　　 2、將重組質粒pMD20-gB作為陽性標準品，利用熒光特異性引物和TaqMan探針建立了一種快速檢測偽狂犬病毒的熒光定量PCR方法。該檢測技術具有較高的靈敏性、特異性和可靠性。對陽性標準品的檢測結果表明，所建立的偽狂犬病毒(PRV)TaqMan熒光定量PCR最低檢測極限可達1.50×102拷貝/反應，相比于普通PCR方法其靈敏度高1000倍以上，并且重復性好。同

5、時對60份臨床樣品的檢測，熒光定量PCR不僅檢出了普通PCR檢測為陽性的樣品，且檢出了2份普通PCR未檢出的樣品，進一步證實了該方法快速、靈敏性好，可用于PRV感染的早期快速定量檢測和肉類食品進出口檢疫。
　　 3、為獲得大量的、成本較低的gB診斷抗原，本研究中用含有EcoRI和XbaI酶切位點的特異性引物，利用普通PCR技術以重組質粒pMD20-gB為模板，重新擴增gB基因全序列，成功構建了含gB主要杭原表位基因的Pichia

6、酵母分泌表達載體pPICZαA-gB，并通過測序和DNAMAN軟件分析表明該基因無突變，蛋白編碼正確無誤，可繼續(xù)試驗。選擇Pichia酵母X-33株感受態(tài)細胞轉化克隆重組表達質粒pPICZαA-gB，30℃溫箱培養(yǎng)一周左右，取單菌落液體培養(yǎng)，提取酵母基因組進行PCR鑒定，結果表明本研究成功獲得了可分泌表達PRV-gB主要杭原表位基因的重組菌。經1％甲醇誘導表達蛋白，通過SDS-PAGE檢測目的蛋白大小約為103KD。同時研究了目的蛋白表

7、達量與各個培養(yǎng)條件的關系，優(yōu)化后的最佳表達條件為：誘導初期的培養(yǎng)液所含菌體濃度OD600值為1.2，28.8℃搖床劇烈震蕩，每24h補加甲醇終濃度為1％，誘導表達時間為72h，蛋白表達量達最大值。在最佳表達條件下所誘導表達的重組蛋白經純化后含量達8.715mg/mL。
　　 4、將以上濃縮純化后的重組蛋白gB作為抗原進行包被，制備ELISA抗體檢測板，對PRV-gB陽性/陰性血清進行間接ELISA檢測。結果顯示，此目的蛋白具有很

8、好的反應原性，可作為檢測用抗原。利用已建立的gB-ELISA方法對豬瘟、豬細小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征的陽性血清進行試驗，結果表明gB蛋白與其他病毒陽性血清無交叉反應，有較好的特異性，可以用于PRV-gB蛋白抗體的檢測。將gB抗原免疫新西蘭大白兔，通過瓊脂擴散試驗和中和試驗測得血清抗體效價平均達到1:8，說明了gB蛋白具有很好的免疫原性。對已達到一定抗體水平的兔子采血，收集血清制備gB抗血清，為規(guī)范診斷檢測試劑和實驗室質量控制提供一定的