豬防御素1基因在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、防御素(defensins)是生物體在抵御病原微生物的防御反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的一類(lèi)重要的抗菌肽類(lèi)物質(zhì)。它具有十分廣泛的抗菌譜，可以抵抗細(xì)菌、真菌、被膜病毒等多種微生物，尤其是哺乳動(dòng)物防御素除了對(duì)細(xì)菌、真菌、被膜病毒有毒殺作用外，還對(duì)支原體、衣原體、螺旋體及一些惡性細(xì)胞有殺傷作用。由于其獨(dú)特的抗菌機(jī)制，不會(huì)誘發(fā)細(xì)菌的耐藥性，成為具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕幬铩?br>　　 豬β防御素-1(porcine β-defensin 1，PBD-1

2、)是廣泛分布于豬消化道、呼吸道、肝、腎等多種組織細(xì)胞內(nèi)的一類(lèi)活性多肽，在豬防御系統(tǒng)中起重要作用，大量研究結(jié)果證明PBD-1具有獨(dú)特的作用機(jī)制，病原菌不易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性。它可被用作食品保鮮劑和飼料添加劑，隨著對(duì)其研究的深入，可以相信豬防御素將在動(dòng)物養(yǎng)殖、疾病預(yù)防和提高畜產(chǎn)品品質(zhì)等方面發(fā)揮更大作用。近年來(lái)，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們希望通過(guò)生物工程手段來(lái)大量生產(chǎn)防御素。由于生物體內(nèi)天然防御素的含量很低，且提取步驟繁瑣，而化學(xué)合成法成本高，

3、因此用基因工程方法大量生產(chǎn)防御素?zé)o疑是最佳選擇。本研究的目的就是在克隆豬舌上皮防御素的基礎(chǔ)上，根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性設(shè)計(jì)并人工合成防御素成熟肽，并利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)二者在體外的分泌表達(dá)，以期獲得更高活性的防御素產(chǎn)品，為豬防御素的工程化生產(chǎn)和畜牧養(yǎng)殖業(yè)奠定基礎(chǔ)。
　　 本實(shí)驗(yàn)以健康豬新鮮豬舌上皮粘膜為實(shí)驗(yàn)材料，以GenBank中報(bào)道的豬防御素PBD-1的cDNA序列及表達(dá)載體pPIC9多克隆位點(diǎn)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物，其中上游引物

4、含有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物含有NotⅠ酶切位點(diǎn)。采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出PBD-1基因的cDNA序列，將其克隆到pGM-T載體中進(jìn)行序列測(cè)定。利用PCR技術(shù)從含有PBD-1基因的重組質(zhì)粒中擴(kuò)增PBD-1基因編碼區(qū)，大小為151 bp，然后插入到分泌型表達(dá)載體pPIC9的EcoRⅠ和NotⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-PBD-1；又根據(jù)畢赤酵母偏好密碼子設(shè)計(jì)并人工合成PBD-1M基因，全長(zhǎng)159 bp?；騈端引入α-信號(hào)肽

5、kex2和Ste13裂解位點(diǎn)，以保證表達(dá)產(chǎn)物具有天然N端，兩端引入XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。將合成的目的基因片段克隆入表達(dá)載體pPIC9中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9-PBD-1M。用BglⅡ?qū)PIC9-PBD-1和pPIC9-PBD-1M線性化后，采用電穿孔法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中進(jìn)行表達(dá)。以重組酵母菌液為模板，經(jīng)PCR檢測(cè)約70％的轉(zhuǎn)化子已正確整合入畢赤酵母染色體中。陽(yáng)性克隆經(jīng)搖瓶發(fā)酵和甲醇誘導(dǎo)，發(fā)酵上清液經(jīng)濃縮處理后進(jìn)行T