偽狂犬病毒基因組在潛伏感染中的時(shí)空表達(dá).pdf

1、偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)是一種具有神經(jīng)嗜性的α型皰疹病毒，可感染豬、牛、羊等多種家畜及野生動(dòng)物。疫苗免疫只能阻止動(dòng)物發(fā)病和臨床癥狀的產(chǎn)生，但不能阻止病毒在宿主體內(nèi)建立潛伏感染。如果淘汰全部PRV潛伏感染豬，需要付出巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)代價(jià)，不符合我國(guó)當(dāng)前的國(guó)情。所以偽狂犬病毒的潛伏感染已成為預(yù)防和根除偽狂犬病的重大障礙。本試驗(yàn)以PRV在豬體內(nèi)建立潛伏感染為基礎(chǔ)，從DNA、RNA等不同層次水平上檢測(cè)了IE18

2、0、EPO、LAT等PRV潛伏感染相關(guān)基因在潛伏感染的建立、維持和激活過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)情況，確定影響PRV潛伏感染的關(guān)鍵基因，為剖析PRV潛伏感染的機(jī)理和偽狂犬病的根除計(jì)劃提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。 本試驗(yàn)購(gòu)買30日齡PRV陰性健康仔豬，進(jìn)行首免和加強(qiáng)免疫，用ELISA和中和試驗(yàn)檢測(cè)仔豬血清抗體水平，當(dāng)血清抗體水平達(dá)到1:或1:2以上時(shí)，我們分別通過(guò)滴鼻和頸部肌肉注射各2 mL病毒液(PRV gG<'->/LacZ<'+>，TCI

3、D<,50>=10<'6.5>/0/1mL)對(duì)仔豬進(jìn)行攻毒。攻毒后1周內(nèi)每天上午和下午分別采集攻毒豬的鼻拭子和測(cè)量體溫，通過(guò)PCR方法檢測(cè)PRV的糖蛋白gD基因，發(fā)現(xiàn)攻毒4天后豬不再向外界排毒；體溫測(cè)量結(jié)果表明，攻毒后豬只體溫迅速升高，在2天左右達(dá)到峰值，而后慢慢降低；每隔一周，我們剖殺試驗(yàn)感染豬，采集血清和三叉神經(jīng)節(jié)、腦、嗅球等神經(jīng)組織及心肌、肺、肝臟、脾臟等臟器，于-80℃冷凍保存。攻毒45天后，按2mg/kg體重的劑量通過(guò)頸部肌肉

4、注射地塞米松，連續(xù)注射5天，以激活PRV的潛伏感染。病毒激活后我們依然每天采集鼻拭子和測(cè)量體溫，其結(jié)果與攻毒后排毒情況和體溫變化結(jié)果基本一致。 在實(shí)驗(yàn)室條件下，我們提取凍存組織的DNA，通過(guò)gD-PCR方法檢測(cè)病毒在豬體內(nèi)的組織分布。驗(yàn)證了神經(jīng)組織，尤其是三叉神經(jīng)節(jié)是病毒建立潛伏感染的最主要位置。本實(shí)驗(yàn)中，檢出率最高的器官為三叉神經(jīng)節(jié)和腦干，均為100％，其次為嗅球、大腦，小腦等神經(jīng)組織，此外淋巴結(jié)和脾臟等淋巴器官的檢出率也較高

5、，心、肝、腎等臟器的檢出率較低。 我們知道，PRV基因組的轉(zhuǎn)錄是級(jí)聯(lián)式的，即立即早期基因、早期基因和晚期基因是按照時(shí)間的先后順序依次表達(dá)，后一期基因的表達(dá)依賴于上一期基因的表達(dá)。我們選取IE180、 EPO和LAT等PRV潛伏感染相關(guān)基因作為研究對(duì)象，在RNA水平上檢測(cè)了各基因的時(shí)空表達(dá)表達(dá)情況。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在潛伏感染過(guò)程中，除了LAT的大量存在和表達(dá)外，IE180基因的表達(dá)也是持續(xù)存在的；而EPO基因一旦在激活中晚期基因的表