偽狂犬病毒基因組在潛伏感染中的時空表達.pdf

1、偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)是一種具有神經(jīng)嗜性的α型皰疹病毒，可感染豬、牛、羊等多種家畜及野生動物。疫苗免疫只能阻止動物發(fā)病和臨床癥狀的產(chǎn)生，但不能阻止病毒在宿主體內(nèi)建立潛伏感染。如果淘汰全部PRV潛伏感染豬，需要付出巨大的經(jīng)濟和社會代價，不符合我國當前的國情。所以偽狂犬病毒的潛伏感染已成為預(yù)防和根除偽狂犬病的重大障礙。本試驗以PRV在豬體內(nèi)建立潛伏感染為基礎(chǔ)，從DNA、RNA等不同層次水平上檢測了IE18

2、0、EPO、LAT等PRV潛伏感染相關(guān)基因在潛伏感染的建立、維持和激活過程中的時空表達情況，確定影響PRV潛伏感染的關(guān)鍵基因，為剖析PRV潛伏感染的機理和偽狂犬病的根除計劃提供實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。 本試驗購買30日齡PRV陰性健康仔豬，進行首免和加強免疫，用ELISA和中和試驗檢測仔豬血清抗體水平，當血清抗體水平達到1:或1:2以上時，我們分別通過滴鼻和頸部肌肉注射各2 mL病毒液(PRV gG<'->/LacZ<'+>，TCI

3、D<,50>=10<'6.5>/0/1mL)對仔豬進行攻毒。攻毒后1周內(nèi)每天上午和下午分別采集攻毒豬的鼻拭子和測量體溫，通過PCR方法檢測PRV的糖蛋白gD基因，發(fā)現(xiàn)攻毒4天后豬不再向外界排毒；體溫測量結(jié)果表明，攻毒后豬只體溫迅速升高，在2天左右達到峰值，而后慢慢降低；每隔一周，我們剖殺試驗感染豬，采集血清和三叉神經(jīng)節(jié)、腦、嗅球等神經(jīng)組織及心肌、肺、肝臟、脾臟等臟器，于-80℃冷凍保存。攻毒45天后，按2mg/kg體重的劑量通過頸部肌肉

4、注射地塞米松，連續(xù)注射5天，以激活PRV的潛伏感染。病毒激活后我們依然每天采集鼻拭子和測量體溫，其結(jié)果與攻毒后排毒情況和體溫變化結(jié)果基本一致。 在實驗室條件下，我們提取凍存組織的DNA，通過gD-PCR方法檢測病毒在豬體內(nèi)的組織分布。驗證了神經(jīng)組織，尤其是三叉神經(jīng)節(jié)是病毒建立潛伏感染的最主要位置。本實驗中，檢出率最高的器官為三叉神經(jīng)節(jié)和腦干，均為100％，其次為嗅球、大腦，小腦等神經(jīng)組織，此外淋巴結(jié)和脾臟等淋巴器官的檢出率也較高

5、，心、肝、腎等臟器的檢出率較低。 我們知道，PRV基因組的轉(zhuǎn)錄是級聯(lián)式的，即立即早期基因、早期基因和晚期基因是按照時間的先后順序依次表達，后一期基因的表達依賴于上一期基因的表達。我們選取IE180、 EPO和LAT等PRV潛伏感染相關(guān)基因作為研究對象，在RNA水平上檢測了各基因的時空表達表達情況。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在潛伏感染過程中，除了LAT的大量存在和表達外，IE180基因的表達也是持續(xù)存在的；而EPO基因一旦在激活中晚期基因的表