傳染性胃腸炎病毒基因組大片段克隆及其主要抗原片段在偽狂犬病病毒中的表達.pdf

1、四川農(nóng)業(yè)大學博士學位論文傳染性胃腸炎病毒基因組大片段克隆及其主要抗原片段在偽狂犬病病毒中的表達姓名：殷華平申請學位級別：博士專業(yè)：預防獸醫(yī)學指導教師：郭萬柱20070601分別與pGMT載體連接，結果僅成功克隆了其中的TGEVA、TGEVB、TGEVF三個片段，分別命名為pTA—A、pTA—B、pGMT。為了在原核細胞和真核細胞中進行S基因主要抗原片段的表達，設計一對引物從TGEV細胞毒RNA中擴增出了包含s基因主要抗原的片段，分別連接

2、pET32a()、pET28a()和pEGFPC1表達載體，獲得重組質(zhì)粒pET32a—S、pET28aS、pEGFPCI一S，并在大場桿菌和Vero細胞中分別進行了原核和真核的表達，結果pET32aS、pET28aS在EcoliBL21細胞中未能獲得良好表達，而pEGFPCIS在Vero細胞中成功地獲得了表達。為了構建表達TGEVS基因主要抗原片段的PRV重組病毒，PCR擴增了s基因主要抗原片段，并克隆到已經(jīng)構建成功的綠色熒光蛋白轉移載

3、體pPPl2EGFP中，命名為pPPl2EGFPS，采用磷酸鈣法將pPPl2EGFPS與SA215病毒基因組DNA共轉染Vero細胞，結果在12小時以后可以觀察到綠色熒光，24～48小時熒光到達最大量，48小時后熒光開始衰退，細胞在轉染48小時后開始出現(xiàn)病變，96小時后細胞75％出現(xiàn)病變；在96小時后可以看見出現(xiàn)發(fā)生重組的綠色熒光病變細胞，挑取病灶反復純化幾次，獲得了表達s基因主要抗原片斷重組病毒PRVSA215S，抽提病毒基因組DNA

4、，PCR擴增能夠從中擴增出大小為17kb的S基因主要抗原片段。應用生物信息學軟件分析了PRY和TGEV全基醫(yī)序列的密碼子偏愛性，分別計算了其RSCU、Nc、Gc、GC囂、雙核苷酸組成，根據(jù)計算的結果運用GGNc分布圖、Gc，z6C。。散點圖、對應分析解析了TGEV和PRV密碼子用法發(fā)生偏愛的主要影響因素，結果表明，PRV主要偏愛于使用以G和C結尾的密碼子，而TGEV則主要使用以A和u結尾的密碼子，影響PRV密碼子偏愛G、C的主要因素是堿