豬傳染性胃腸炎病毒分離及部分特性鑒定.pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）屬冠狀病毒科，冠狀病毒屬，是豬病毒性腹瀉的重要病原體之一。該病毒引起的豬傳染性胃腸炎(Transmissiblegastroenteritis，TGE)以嚴重腹瀉、嘔吐和脫水為主要臨床特征。TGE發(fā)病急，流行范圍廣，且經(jīng)常與豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，PRV）和豬流行性腹瀉病毒(Porcine ep

2、idemic diarrheavirus，PEDV)等其他病毒或細菌混合感染，從而加重了其發(fā)病和死亡，給畜牧業(yè)造成嚴重的損失。對TGEV流行毒株的分離與鑒定，無論是對該病的基礎(chǔ)性研究或病毒相關(guān)生物產(chǎn)品研制及疾病的科學(xué)防控都有重要意義。
　　本研究以TGEV糞便病料為材料，比較了TGEV在豬原代睪丸細胞，傳代細胞系ST細胞以及PK15細胞上的增殖情況。病毒在三種細胞上連續(xù)傳代，傳至25代左右，提取核酸檢測，通過RT-PCR測定病毒在

3、三種細胞的增殖情況，測定結(jié)果顯示，病毒在這三種細胞上均可擴增出病毒特異條帶。通過對不同代次細胞毒的TCID50測定比較，在ST傳代細胞病毒滴度與其他兩種細胞滴度相當，且在ST細胞出現(xiàn)病變最早，故本實驗選擇ST細胞來進行TGEV病毒的連續(xù)培養(yǎng)。
　　當病毒適應(yīng)ST細胞系后，用TGEV，PED，PRV特異性引物對病毒進行檢測。經(jīng)過核酸檢測證明除TGEV外，細胞培養(yǎng)物中還可檢測到PEDV和PRV，表明在進行TGEV傳代過程中，存在有三種

4、病毒的細胞混合感染。為使TGEV得到純化，本研究采用蝕斑純化技術(shù)對病毒進行了純化。通過對TGEV蝕斑形成試驗的摸索，確定了蝕斑形成條件為:瓊脂糖濃度為1.6％，培養(yǎng)液-瓊脂糖混合培養(yǎng)液的最適溫度約30℃，瓊脂糖厚度3mm，中性紅濃度為0.02％。通過核酸檢測為TGEV陽性的蝕斑毒繼續(xù)進行蝕斑試驗，直致蝕斑大小形態(tài)一致，且核酸檢測TGEV陽性。
　　對純化后的病毒在ST細胞上連續(xù)傳代，利用核酸檢測，證明病毒可在在細胞上的穩(wěn)定增殖。間

5、接免疫熒光檢測接種TGEV病毒，可產(chǎn)生特異性熒光，電鏡觀察觀察表明。病毒直徑約150nm左右，病毒粒子具有典型的冠狀結(jié)構(gòu);病毒感染ST細胞后進行超薄切片電鏡觀察，可看到病毒彌散的存在于細胞質(zhì)中，直徑在60-100nm。
　　本實驗對純化后病毒的部分理化特性進行了測定，結(jié)果顯示，病毒對熱敏感，60℃水浴30min即可完全失活;病毒不耐酸堿，在PH為3和PH為9的條件下病毒滴度明顯降低。該病毒對有機試劑如乙醚氯仿等較敏感。