豬傳染性胃腸炎病毒HX株的分離與鑒定及其PL蛋白對(duì)抗IFN-β的分子機(jī)制.pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)是引起豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)的病原。臨床方面表現(xiàn)為嚴(yán)重脫水、嘔吐和水樣腹瀉，是一種高度接觸性和急性傳染病。各年齡段的豬對(duì)TGEV都易感，特別能夠引起兩周齡以下的仔豬死亡，致死率為100％。TGE流行范圍非常廣，發(fā)病率和致死率極高，是我國(guó)和其他國(guó)家仔豬死亡的重

2、要疫病之一，并且給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。
　　本實(shí)驗(yàn)從黑龍江省哈爾濱市周邊某豬場(chǎng)收集腹瀉仔豬的糞便通過(guò)TGEV的N基因引物進(jìn)行RT-PCR鑒定，擴(kuò)增到一段約1100 bp的基因序列，同時(shí)用PRRSV、PEDV和PRV的引物進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)沒(méi)有擴(kuò)增到目的基因，將擴(kuò)增得到的目的基因與pMD18-T載體連接后進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明該基因序列與TGEV核苷酸序列相似性為98.5％，這說(shuō)明腹瀉仔豬的糞便中含有TGEV。將該糞便病料經(jīng)適當(dāng)離

3、心，0.22μm過(guò)濾后接種PK15細(xì)胞。經(jīng)過(guò)盲傳8代后細(xì)胞出現(xiàn)典型病變，利用透射電鏡觀察確定該病毒的形態(tài)是有囊膜的冠狀病毒，直徑大小在80～100 nm，將該病毒分離株命名為T(mén)GEV-HX株。分別設(shè)計(jì)10對(duì)引物對(duì)HX株進(jìn)行全基因組測(cè)序，可以成功拼接成28580 bp，基因組上依次為5'-UTR-ORF1a-ORF1b-S-ORF3a-ORF3b-E-N-ORF7-3'UTR。與國(guó)內(nèi)分離株同源性很高，遺傳進(jìn)化樹(shù)分析顯示HX株與Purdue

4、在同一個(gè)進(jìn)化分支，與疫苗株H165進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　固有免疫是宿主抵御微生物入侵的第一道防線，主要過(guò)程分為干擾素(IFNs)合成通路和IFNs信號(hào)通路，IFNs與相應(yīng)受體結(jié)合后激活JAK/STAT途徑，進(jìn)而激活I(lǐng)SGs產(chǎn)生，最終導(dǎo)致抗病毒感染平臺(tái)產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用TGEVHX和UV-TGEV HX分不同時(shí)間段分別感染PK-15，收集細(xì)胞后提取總RNA后，采用qRT-PCR方法檢測(cè)IFN-α1，IFN-β，IL6，IL12，TN

5、F-α, IRF7, Mx1，ISG56，STAT1和β-actin的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而分析TGEV HX與固有免疫細(xì)胞因子之間的相互關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGEV HX能夠通過(guò)其自身復(fù)制抑制IFN-α1，IFN-β，TNF-α，IRF7和ISG56的轉(zhuǎn)錄，對(duì)于IL6，IL12和STAT1轉(zhuǎn)錄水平與UV-TGEV相當(dāng)，而TGEV能夠誘導(dǎo)高水平的Mx1基因轉(zhuǎn)錄。這說(shuō)明TGEV利用其自身復(fù)制調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而完成病毒復(fù)制和傳播。
　　所有冠

6、狀病毒都編碼木瓜樣蛋白酶(PL)，負(fù)責(zé)將病毒早期ORF1合成的多聚蛋白切割開(kāi)來(lái)，是病毒復(fù)制必需基因。SARS，NL63，PEDV和MHV中都發(fā)現(xiàn)PL蛋白有抑制IFN-β通路的作用，而TGEV也存在PL蛋白，且晶體結(jié)構(gòu)分析表明TGEVPL與SARS PL結(jié)構(gòu)相似，說(shuō)明存在相似的功能。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)TGEV PL蛋白能夠抑制IFN-β的合成并且不依賴(lài)于其催化活性。PL能夠定位于線粒體中不能影響STING形成的二聚體，但是具有去泛素化功能能夠