豬傳染性胃腸炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp14誘導(dǎo)IFn-β的分子機(jī)制.pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起豬的傳染性胃腸炎，該病以感染豬的嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和脫水為主要特征，不同年齡的豬均易感，兩周齡以內(nèi)仔豬的感染死亡率可高達(dá)100％。TGEV還常與豬流行性腹瀉病毒、豬δ冠狀病毒等引起腹瀉的病毒發(fā)生混合感染，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　干擾素(IFN)及其誘導(dǎo)的干擾素刺激因子是宿主抗病毒感染的重要防御機(jī)制，為了能有效感染宿主和增殖，很多病毒進(jìn)化出各種策略拮抗宿主IFN的抗病毒作用，但也有些病毒

2、感染后能誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生。有研究證實(shí)TGEV感染能誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生，但對(duì)其分子機(jī)制研究甚少?；诖?，本研究對(duì)TGEV感染激活I(lǐng)FN-β的分子機(jī)制進(jìn)行了初步探討，以期為進(jìn)一步闡明TGEV的免疫機(jī)理和致病機(jī)制及有效預(yù)防和控制TGEV感染提供理論依據(jù)。
　　1.TGEV感染PK-15細(xì)胞呈劑量依賴性激活I(lǐng)FN-β
　?、裥透蓴_素作為主要的抗病毒效應(yīng)分子在宿主體內(nèi)廣泛表達(dá)，參與宿主免疫調(diào)控并誘導(dǎo)抗病毒效應(yīng)。將TGEV以不同劑量感染P

3、K-15細(xì)胞，利用啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)證實(shí)TGEV感染顯著激活I(lǐng)FN-β、IRF3和NF-κB，且呈劑量依賴性。說明TGEV感染激活I(lǐng)FN-β可能同時(shí)依賴于IRF3和NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。
　　2.TGEV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp14顯著激活I(lǐng)FN-β
　　許多病毒編碼蛋白會(huì)參與激活或調(diào)節(jié)IFN-β信號(hào)通路。將TGEV所有編碼蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒分別與IFN-β、NF-κB和IRF3啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒及內(nèi)參質(zhì)粒共

4、轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，雙熒光素酶檢測(cè)證實(shí)TGEV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp14能顯著激活I(lǐng)FN-β和NF-κB，但對(duì)IRF3的激活倍數(shù)不高，說明TGEV nsp14對(duì)IFN-β的激活主要依賴于NF-κB。
　　3.TGEV nsp14誘導(dǎo)NF-κB活化的分子機(jī)制
　　p65的磷酸化和轉(zhuǎn)核是NF-κB活化的標(biāo)志，通過Western blot和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TGEV nsp14能夠促進(jìn)p65的磷酸化和轉(zhuǎn)核。進(jìn)一步將TGE

5、V nsp14的截短突變體和酶活性位點(diǎn)突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒和NF-κB啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，熒光素酶活性檢測(cè)證實(shí)nsp14的外切核酸酶活性和N7-甲基轉(zhuǎn)移酶活性都與其誘導(dǎo)NF-κB活化有關(guān)。
　　4.TGEV激活I(lǐng)FN-β的信號(hào)通路機(jī)制研究
　　解旋酶蛋白DDX1是新發(fā)現(xiàn)的識(shí)別受體，研究證實(shí)SARS-CoV和IBV編碼的nsp14蛋白都能與DDX1相互作用，為了確定TGEV nsp14是否通過DDX1誘導(dǎo)IFN-

6、β及其信號(hào)通路。首先通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)nsp14與DDX1是否存在相互作用進(jìn)行了檢測(cè)，證實(shí)兩種蛋白確實(shí)存在相互作用。進(jìn)一步通過超表達(dá)或者干擾DDX1，熒光素酶系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)超表達(dá)DDX1能夠協(xié)同nsp14誘導(dǎo)IFN-β產(chǎn)生，而干擾DDX1的作用則相反，表明TGEV nsp14通過宿主蛋白DDX1誘導(dǎo)抗病毒反應(yīng)。最后通過檢測(cè)干擾DDX1后TGEV誘導(dǎo)的IFN-β、ISGs和炎癥因子產(chǎn)生水平的變化，發(fā)現(xiàn)TGEV誘導(dǎo)的抗病毒

7、反應(yīng)均顯著下調(diào)，提示TGEV很可能通過nsp14與DDX1的互作介導(dǎo)宿主的免疫識(shí)別，從而激活抗病毒反應(yīng)。
　　5.DDX1對(duì)TGEV增殖的影響初步研究
　　許多解旋酶蛋白能夠通過與病毒編碼蛋白互作，幫助或抑制病毒的增殖。為了分析DDX1對(duì)TGEV增殖的影響，通過超表達(dá)或干擾DDX1，TCID50檢測(cè)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)，確定DDX1對(duì)TGEV的增殖有一定的抑制作用。
　　6.TGEV感染對(duì)