豬傳染性胃腸炎病毒膠體金免疫層析試紙條的研制.pdf

1、本研究旨在建立快速，簡(jiǎn)便地檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的膠體金免疫層析方法。 ⑴利用辛酸-飽和硫酸銨法和親和層析柱聯(lián)合法純化兔抗TGEVN蛋白的多克隆抗體及抗TGEVN蛋白的單克隆抗體。純化后的多抗?jié)舛葹?.692mg/ml，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析IgG重鏈和輕鏈區(qū)帶明顯，純度為100％。血清抗體效價(jià)由2.56×105下降為6.4×104。純化后的單抗?jié)舛葹?.933mg/ml，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析IgG重鏈和輕鏈區(qū)帶明顯，

2、純度為100％。腹水抗體效價(jià)由6.4×104下降為1.6×104。純化后的多抗和單抗可分別用于檢測(cè)和標(biāo)記。 ⑵采用檸檬酸三鈉法制備20nm膠體金，通過肉眼觀察，可見金溶液為酒紅色，透明均勻。通過電鏡掃描觀察到，金顆粒分布均勻，大小均一。紫外掃描觀察到最大吸收峰波長(zhǎng)為520nm，峰寬較小，說明膠體金顆粒分布比較均勻。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所制備的金顆粒可以用于標(biāo)記單抗。 ⑶用所制的金顆粒標(biāo)記單克隆抗體，通過實(shí)驗(yàn)確定了穩(wěn)定1ml膠體金

3、所需的最小蛋白用量為0.2mg，最適pn值為7.6。將金標(biāo)抗體噴涂在玻璃纖維膜上，在試紙條連接的硝酸纖維素膜上固定有抗TGEVN蛋白的多克隆抗體作為檢測(cè)線，羊抗鼠IgG的抗體作為質(zhì)控線，在膜的另一端為吸收樣品的吸水紙墊。當(dāng)被檢測(cè)樣品加入樣品墊后，液體便流向免疫膠體金結(jié)合墊，然后流向硝酸纖維素膜并最終流向吸水紙墊。如果樣品中含有豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)，膜上便會(huì)出現(xiàn)肉眼可見的紅色檢測(cè)線，如果樣品中無豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)，則

4、不會(huì)在膜上顯示可見的紅色線檢測(cè)線。 本研究對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒膠體金免疫層析試紙條的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，選擇了效果較好的多抗包被液(0.01MpH7.4PBS)，封閉液(0.01MpH7.4PBS含2％BSA)，金標(biāo)稀釋液(0.01MpH7.4PBS含0.1％BSA，0.5％蔗糖)，硝酸纖維素膜(HF135)，玻璃纖維膜(PR-NJ25)，樣品墊(PR-VL78)和吸收墊(CH-270K)。確定了最佳的封閉條件為室溫封閉10min

5、。并確定了NC膜上多抗的包被濃度為0.0169mg/ml，玻璃纖維膜上金標(biāo)抗體的噴涂量為0.037mg/ml。探索了膠體金免疫層析檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的方法，使用試紙條對(duì)TCID50為10-5.8的病毒培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限為100TCID50。經(jīng)測(cè)試，試紙條與豬流行性腹瀉病毒，輪狀病毒和豬細(xì)小病毒無交叉反應(yīng)，重復(fù)性較好，4℃條件下密封保存90天后仍能有效檢測(cè)樣品。此方法最大的優(yōu)點(diǎn)是無需借助檢測(cè)儀器，檢測(cè)所需試劑都已事先包被在試紙條上