布魯氏菌病與萊姆病膠體金免疫層析試紙條的研制.pdf

1、布魯氏菌病是由布魯氏桿菌侵入機(jī)體而引起的慢性細(xì)菌性人畜共患病。布魯氏菌可感染人類、多種家畜和野生動(dòng)物,嚴(yán)重影響著畜牧業(yè)的發(fā)展和公共衛(wèi)生安全。因此,針對(duì)該病研發(fā)出快速、有效的診斷方法是非常必要的。目前,針對(duì)該病的診斷國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼建立了許多方法,雖然有些方法頗有成效,但存在著價(jià)格高、操作繁瑣、專業(yè)性強(qiáng)等缺點(diǎn)而不適合基層布病的準(zhǔn)確診斷。因此,建立一種廉價(jià)、敏感性高、特異性好、操作方便、適用于基層布病快速診斷的方法迫在眉睫。本研究基于布魯氏菌

2、表面蛋白以膠體金為標(biāo)記材料建立了一種布魯氏菌病快速診斷方法,為基層布病準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的大量初步篩查提供技術(shù)支持。
　　萊姆病是一種由蜱傳播疏螺旋體而引起的人畜共患病,該病能引起人和動(dòng)物的多個(gè)組織器官的損傷。感染伯氏疏螺旋體的人和動(dòng)物大多經(jīng)歷萊姆病的多個(gè)時(shí)期,且各個(gè)時(shí)期呈現(xiàn)不同的臨床癥狀,極容易與其它疾病混淆,嚴(yán)重的危害著公共衛(wèi)生安全。目前,國(guó)內(nèi)對(duì)該病在診斷方面的研究甚少?；诓鲜杪菪w外膜蛋白抗原具有一定的免疫原性的特點(diǎn),本研

3、究通過(guò)原核表達(dá)的方法獲得萊姆病螺旋體抗原蛋白,并對(duì)其血清學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行了初步研究。
　　目的:建立一種新的布魯氏菌病及萊姆病螺旋體膠體金免疫層析檢測(cè)方法。
　　本文對(duì)布魯氏菌病和萊姆病兩個(gè)新疆高發(fā)的人獸共患病主要研究成果報(bào)告如下:
　　1.布魯氏菌表面蛋白的純化及驗(yàn)證:使用親和層析的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的布魯氏菌表面蛋白BP26、VirB5、SP41及OMP31進(jìn)行純化,通過(guò)WB試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)驗(yàn)證四個(gè)表面蛋白的反應(yīng)原

4、性和免疫原性。結(jié)果顯示:獲得了高純度的重組蛋白,且四個(gè)融合蛋白均具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性,為后續(xù)布魯氏菌病免疫層析試紙條的制備奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　2.布魯氏菌病免疫層析檢測(cè)試紙條的制備:以純化的布魯氏菌表面蛋白BP26、VirB5、SP41及OMP31為檢測(cè)抗原,利用檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法制備膠體金免疫層析試紙條,對(duì)反應(yīng)的各個(gè)條件進(jìn)行了優(yōu)化,最終使用布病VirB5蛋白制備出膠體金免疫層析試紙條。用琥紅平板凝集試驗(yàn)、試管

5、凝集試驗(yàn)及制備的免疫層析試紙條分別對(duì)166份綿羊血清樣本進(jìn)行檢測(cè):陽(yáng)性率分別為34.3％(57/166)、36.7%(61/166)、和36.1%(60/166), RBPT檢出的57份陽(yáng)性均能被試紙條檢出,與試管凝集符合率為98.4%。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程在10min內(nèi)便可完成;制備的免疫層析試紙條具有準(zhǔn)確性高、敏感性好、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。
　　3.萊姆病伯氏疏螺旋體外膜蛋白OspA和BmpA的原核表達(dá)、純化及驗(yàn)證:構(gòu)建萊姆病伯氏疏螺旋體

6、OspA和BmpA原核表達(dá)系統(tǒng),使用親和層析對(duì)蛋白OspA和BmpA進(jìn)行純化,通過(guò)WB驗(yàn)證蛋白的反應(yīng)原性。結(jié)果顯示:獲得了高純度的重組蛋白,且融合蛋白均具有良好的反應(yīng)原性,為進(jìn)一步制備萊姆病免疫層析試紙條奠定基礎(chǔ)。
　　4.萊姆病螺旋體快速診斷試紙條的制備:膠體金制備的方法、膠體金顆粒的質(zhì)量鑒定及抗原標(biāo)記條件均同布魯氏菌病免疫層析試紙條制備一致,以萊姆病外膜蛋白 OspA和BmpA分別作為檢測(cè)抗原,制備膠體金免疫層析試紙條并對(duì)其特

7、異性、敏感性等作出評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示:試紙條最高可檢出兔萊姆病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清為1:200。20份疑似萊姆病的綿羊血清樣本中共檢出2份陽(yáng)性,與標(biāo)準(zhǔn)法western blot檢測(cè)的符合率為100%。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程在10min內(nèi)便可完成;本試紙條在4℃冰箱中可保存半年以上。
　　結(jié)論:成功表達(dá)、純化了布魯氏菌的四個(gè)表面蛋白并首次以表面蛋白VirB5為診斷抗原制備出膠體金免疫層析試紙條;構(gòu)建了萊姆病OspA、BmpA基因的原核表達(dá)系統(tǒng),并在國(guó)內(nèi)首