湖羊早期妊娠診斷免疫膠體金層析試紙條的初步研制.pdf

1、在妊娠早期，母畜外周血漿中的孕酮含量遠遠高于發(fā)情期，所以可以通過測定血液中的孕酮含量來進行早期妊娠診斷。傳統(tǒng)的測定方法主要有放射免疫測定法（RIA），酶免疫測定法（EIA）和乳膠凝集測定試驗（LAIT），但是由于操作比較復雜，所以并未得到廣泛的應用。膠體金免疫層析技術是2世紀90年代在免疫滲濾技術基礎上建立的一種簡易快速的免疫檢測技術，其檢測結果通過肉眼即可判斷。這種技術具有操作簡便，操作時間短等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛地應用于食品安全和激素的檢

2、測。
　　 本試驗采用膠體金免疫層析技術，根據(jù)試驗確立的湖羊妊娠孕酮臨界值，應用競爭法研制出一種膠體金免疫層析試紙條；通過對配種后21 d左右湖羊血液中的孕酮進行半定量測定，進行早期妊娠診斷，具有很好的應用價值。試驗的主要內(nèi)容包括以下3個部分：
　　 1.對85頭配種后21 d左右未出現(xiàn)返情的湖羊采用放射免疫測定法（RIA）測定其外周血中的孕酮含量。研究結果表明，妊娠羊的孕酮含量為2.33±0.70ng/mL，未妊娠羊的

3、孕酮含量為1.24±0.33ng/mL，懷孕羊的孕酮水平高于未懷孕羊，且差異顯著（P<0.05）。設定孕酮含量大于1.7ng/mL為妊娠，低于1.5n咖L為未妊娠，介于兩者之間為疑似懷孕。根據(jù)上述標準，妊娠確診率為100％，未妊娠確診率為82.61％，疑似妊娠確診率為64％。
　　 2.為了獲得高質量的金標孕酮單抗，通過采用檸檬酸三鈉還原法制備出符合要求的30 nm的膠體金溶液，在此基礎上摸索膠體金標記孕酮單克隆抗體的最佳條件，

4、并對其進行質量鑒定。用檸檬酸三鈉還原法制備的30 nm膠體金溶液呈深紅色，透射電鏡觀察，膠體金顆粒大小基本一致；膠體金標記孕酮單克隆抗體的最低穩(wěn)定濃度為16μg/mL，最適穩(wěn)定濃度為19.2μg/mL，最適標記pH為8.5。經(jīng)電鏡觀察，制備的金標抗體復合物周圍有一層明顯的低電子密度暈圈，且其在520 nm處的OD值在0.2～0.4范圍內(nèi)。
　　 3.利用膠體金免疫層析技術競爭法原理，根據(jù)試驗所得的湖羊早孕診斷血液孕酮臨界值，用金

5、標孕酮單抗復合物為探針制成金標墊，同時用11α-羥孕酮琥珀酸酯與BSA的偶聯(lián)物和羊抗小鼠IgG二抗包被硝酸纖維素膜分別作為檢測線和質控線，制備了半定量檢測孕酮的膠體金免疫層析試紙條。結果采用國產(chǎn)SB-08玻璃纖維膜作為樣品墊材料，進口Ahlstrom8964玻璃纖維膜作為金標墊，Millipore135硝酸纖維素（NC）膜作為層析材料制成試紙條。檢測線和質控線上的包被濃度分別為1.6mg/mL和1.2mg/mL，金標孕酮單抗按1:2稀釋