人心肌肌鈣蛋白I膠體金免疫層析試紙條的研制及初步應(yīng)用.pdf

1、人心肌肌鈣蛋白I(human cardiac troponin I,hcTnI)是檢測(cè)心肌損傷的重要標(biāo)志物。目前,臨床檢測(cè)cTnI的方法很多,但由于不同的cTnI片段清除率和降解速度不同、所用抗體針對(duì)的抗原表位和抗體親和力不同、以及標(biāo)準(zhǔn)品不同等因素的影響,使檢測(cè)結(jié)果間存在很大差異。據(jù)研究報(bào)道,不同方法之間檢測(cè)結(jié)果的差異可達(dá)100倍,因此,開(kāi)展cTnI檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化研究是十分必要的。目前,我國(guó)尚無(wú)自主研制的cTnI診斷試劑盒,臨床使用的

2、均為國(guó)外進(jìn)口或國(guó)外原料國(guó)內(nèi)組裝試劑盒,這樣既增加了檢測(cè)成本,也加重了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),從而限制了這一靈敏度高、特異性強(qiáng)的生化標(biāo)志物在臨床上的廣泛應(yīng)用。
　　 本研究以重組hcTnI為抗原篩選出的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株為基礎(chǔ),研制出高效價(jià)、高特異性的單克隆抗體,成功建立了hcTnI膠體金免疫層析檢測(cè)方法,對(duì)其靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性等進(jìn)行了檢測(cè),并初步應(yīng)用于臨床。
　　 單克隆抗體的大量制備采用動(dòng)物體內(nèi)誘生腹水法,通過(guò)正辛酸

3、-飽和硫酸銨沉淀法進(jìn)行初步純化,然后經(jīng)Protein A Spharose CL-4B親和層析柱進(jìn)一步純化,獲得了高純度的單克隆抗體；以重組heTnI為抗原免疫新西蘭大耳白兔制備多克隆抗體,采用正辛酸-飽和硫酸銨沉淀法純化抗血清并鑒定抗體性質(zhì),研制出了兔源抗hcTnI多克隆抗體。
　　 制備膠體金的方法很多,但其主要原理均為氯金酸在還原劑作用下可以聚合成特定大小的金顆粒。本研究采用檸檬酸三鈉還原法制備了膠體金；通過(guò)免疫層析技術(shù)制

4、備快速檢測(cè)cTnI的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條,其主要步驟為:以鼠源抗cTnI單克隆抗體進(jìn)行膠體金標(biāo)記作為標(biāo)記抗體,與樣本中的hcTnI結(jié)合。以兔源抗cTnI多克隆抗體固定于硝酸纖維素膜上作為捕獲抗體,通過(guò)捕獲與膠體金標(biāo)記抗體結(jié)合的cTnI作為檢測(cè)線。羊抗鼠lgG通過(guò)與膠體金標(biāo)記抗體結(jié)合作為質(zhì)控線；另外本研究研制成的膠體金免疫層析試紙條還與ALFA Scientific designs INC的膠體金試劑盒做了檢測(cè)對(duì)比。
　　 經(jīng)

5、過(guò)條件優(yōu)化,本研究成功獲得了cTnI膠體金免疫層析試紙條。該試紙條的檢測(cè)范圍為5ng/ml～1μg/ml；靈敏度為5ng/ml；特異性:與肌紅蛋白(myoglobin,Mb)、肌酸磷酸激酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)、cTnT和cTnC均無(wú)交叉反應(yīng):與進(jìn)口膠體金試紙條檢測(cè)結(jié)果比較:陽(yáng)性符合率為96.4％；陰性符合率為100％。
　　 綜上所述,本研究成功建立了cTnI膠體金免疫層析檢測(cè)方法,該方法具