膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)新城疫病毒方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、新城疫是世界公認(rèn)的最重要的禽類(lèi)傳染病之一，是由新城疫病毒引起的高度接觸性、傳染性疫病，可導(dǎo)致禽類(lèi)的大量死亡或生產(chǎn)性能的急劇下降，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究針對(duì)新城疫病毒檢測(cè)方法中存在的問(wèn)題，運(yùn)用膠體金免疫層析技術(shù)，采用雙抗體夾心原理，建立了新城疫病毒的快速檢測(cè)方法。 本研究首先以純化的小鼠IgG免疫兔，制備兔抗鼠血清，并用飽和硫酸銨鹽析法提純兔抗鼠IgG；然后以Protein G親和層析法純化兩株抗新城疫病毒(NDV

2、)融合蛋白(F)單克隆抗體(抗NDV-F6C4單抗、抗NDV-F4D9單抗)，提純前后的抗體用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析純化效果。結(jié)果顯示，純化后的抗體雜蛋白含量少，純度較高。 采用檸檬酸三鈉還原法，成功制備了30nm的膠體金，以透射電鏡觀察其質(zhì)量，結(jié)果為直徑為30nm的膠體金顆粒，大小均勻，呈分散狀態(tài)的橢圓形。以制備好的膠體金進(jìn)行標(biāo)記條件摸索，成功確立了單克隆抗體的膠體金標(biāo)記條件：最適pH值是8.7，抗體的最佳

3、結(jié)合量為6.6μg/ml，并制備了金標(biāo)記的NDV-F6C4單克隆抗體。 以膠體金標(biāo)記的抗NDV-F6C4單克隆抗體制備免疫金墊，吸附于玻璃纖維；以抗NDV-F4D9單克隆抗體和兔抗鼠IgG分別噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜上，成為T(mén)線(xiàn)和C線(xiàn)，采用制備雙抗體夾心法，制備成NDV免疫層析快速檢測(cè)試紙條。經(jīng)試驗(yàn)，膠體金標(biāo)記抗體最適稀釋度是1：2，以30ul/cm噴膜；T線(xiàn)為0.6ul/cm的單克隆抗體(3.0mg/ml)，C線(xiàn)為0.6ul/cm兔