犬瘟熱病毒單克隆抗體夾心ELISA方法的建立與膠體金免疫層析試紙條的制備.pdf

1、犬瘟熱(Canine Distemper, CD)是犬等肉食動(dòng)物中的一種高度接觸性、致死性傳染病，是危害犬養(yǎng)殖業(yè)、毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)及野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)最嚴(yán)重的疫病之一。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在建立犬瘟熱病毒單克隆抗體夾心ELISA方法、制備膠體金免疫層析試紙條，適用于臨床犬瘟熱病毒的快速檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括兩部分:
　　 實(shí)驗(yàn)一:將分泌犬瘟熱病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株1D7和3H11，分別腹腔注射BALB/c小鼠，制備單克隆抗體腹水

2、，純化并鑒定。將單克隆抗體3H11加以辣根過氧化物酶標(biāo)記，以單抗1D7作為包被抗體，以酶標(biāo)抗體3H11作為檢測(cè)抗體，建立檢測(cè)犬瘟熱病毒的單克隆抗體夾心ELISA方法。對(duì)最佳工作條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定:單抗1D7的包被濃度為20μg/mL，包被最佳條件為4℃過夜，最佳封閉液為5％的脫脂奶粉，酶標(biāo)抗體工作濃度為1∶4000。
　　 包被的犬瘟熱抗體與犬細(xì)小病毒(CPV)、犬冠狀病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒Ⅰ型

3、(CAV-Ⅰ)等無交叉反應(yīng);建立雙抗夾心ELISA方法可以檢測(cè)到的最低病毒含量為102 TCID50/mL;板內(nèi)和板間變異系數(shù)在0.5％～6.3％之間;對(duì)50份臨床樣品檢測(cè)并與商品試劑盒比較，兩者共同符合率為92％。以上試驗(yàn)結(jié)果表明建立的犬瘟熱病毒雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、敏感度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。
　　 實(shí)驗(yàn)二:采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，標(biāo)記純化的單抗3H11，制備金標(biāo)抗體玻璃纖維素膜;將純化的單抗1D7

4、作為捕獲抗體，固定于硝酸纖維素膜(NC)上，制備膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條。對(duì)最佳工作條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定:膠體金標(biāo)記抗體3H11的最佳濃度為17μg/mL，標(biāo)記最佳pH值為8.0;包被于NC膜的抗體1D7濃度為2.0 mg/mL。
　　 制備的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條不與犬細(xì)小病毒(CPV)、犬冠狀病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒(CAV-1)等發(fā)生交叉反應(yīng);敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，試紙條可以檢測(cè)到的最低病毒含