鴨瘟病毒gB蛋白單克隆抗體的制備及膠體金試紙條檢測方法的建立和應(yīng)用.pdf

1、鴨瘟是由鴨瘟病毒引起的一種急性、敗血性傳染病，以頭頸腫脹、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、黃白色潰瘍，頭頸部皮下有黃白色膠凍樣滲出為特征。該病一旦發(fā)生，發(fā)病急、死亡快、死亡率高，對養(yǎng)鴨業(yè)危害嚴(yán)重。免疫預(yù)防是控制鴨瘟的重要措施，但近年來不斷出現(xiàn)鴨瘟疫苗免疫效果不佳的情況，鴨瘟病毒是否發(fā)生變異，找出其中的原因至關(guān)重要?？焖僭\斷是控制鴨瘟的重要措施之一，目前已建立了PCR、ELISA、間接免疫熒光技術(shù)、微量中和試驗(yàn)等檢測鴨瘟的方法，但是這幾種檢測方

2、法均需特殊的儀器設(shè)備，且耗時長，不適于在基層推廣應(yīng)用。因此，建立一種更加快速、靈敏的病毒檢測方法迫在眉睫。膠體金免疫層析技術(shù)是近年來發(fā)展起來的集膠體金標(biāo)記技術(shù)、蛋白層析技術(shù)于一體的新型快速免疫檢測技術(shù)。該技術(shù)操作簡便、耗時短，不需要特殊的儀器設(shè)備，特別適合在基層推廣應(yīng)用。單克隆抗體具有性質(zhì)均一穩(wěn)定、特異性高等特點(diǎn)，可以作為病毒診斷方法的一個良好的工具。作為鴨瘟病毒的高度保守性蛋白之一，gB蛋白的免疫原性良好，高度的特異性和保守性決定了該

3、蛋白能夠?yàn)榻⑿碌臋z測方法提供良好的材料。
　　本研究通過對近幾年來從各地采集的鴨瘟病料，擴(kuò)增DPV主要基因gBgC基因并進(jìn)行測序比對分析，從分子水平上研究鴨瘟病毒變異情況。制備針對鴨瘟病毒gB蛋白的單克隆抗體，并利用制備的單抗，建立了膠體金試紙條檢測方法。
　　本研究設(shè)計鴨瘟病毒gBgC基因的特異性引物，將近幾年來各地送檢疑似鴨瘟病料處理后，采用鴨胚尿囊膜接種法分離鴨瘟病毒，提取病毒DNA作為模板。PCR擴(kuò)增目的基因，連接

4、于載體pMD-18T上，將PCR鑒定為陽性的菌液測序，與NCBI上已發(fā)表的鴨瘟強(qiáng)毒株2085(序列號:JF999965)及鴨瘟弱毒疫苗株VAC(序列號:EU082088)序列進(jìn)行比對，同時比對不同毒株之間的同源性。結(jié)果顯示，測序的9株鴨瘟病毒的同源性在99‰100％之間，表明鴨瘟病毒主要基因未發(fā)生變異。
　　利用生物學(xué)軟件Protean分析，選擇鴨瘟病毒抗原表位較多的一段序列設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增目的基因。連接到載體pMD-18T上

5、，測序正確后再連接到原核表達(dá)載體pET-28a上。將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)的蛋白經(jīng)純化后測其濃度并經(jīng)western blot鑒定分析。
　　以表達(dá)的DPV-gB蛋白作為抗原，免疫7周齡BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)間接ELISA篩選及亞克隆，共獲得4株能穩(wěn)定分泌抗DPV-gB蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為A8D7、E6C3、H11F8、H6F6。間接ELIS

6、A檢測腹水效價分別為1∶103、1∶103、1∶105、1∶103。亞類鑒定結(jié)果分別為IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1，輕鏈均為kappa鏈。Western blot結(jié)果顯示4株單抗均能與DPV-gB蛋白特異性結(jié)合。IFA結(jié)果顯示制備的4株單抗是針對DPV產(chǎn)生的。
　　在獲得DPV-gB特異性單克隆抗體的基礎(chǔ)上，采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，以制備的H6F6單抗作為標(biāo)記抗體（標(biāo)記的最適pH值為8.0～8.5，最佳

7、標(biāo)記濃度為15倍原液稀釋），將純化的A8D7單抗（濃度為2倍原液稀釋）和羊抗鼠IgG（濃度為10倍稀釋）包被在硝酸纖維素膜(NC)上，分別作為檢測線和質(zhì)控線，經(jīng)條件優(yōu)化建立了鴨瘟病毒膠體金試紙條檢測方法。檢測結(jié)果顯示:該試紙條能夠特異地檢測鴨瘟病毒，與DRV、EDS-76V、AIV-H9N2、TMUV均無交叉反應(yīng);陽性尿囊液稀釋50倍后用該試紙條檢測依然為陽性;用不同批次的試紙條重復(fù)檢測，結(jié)果無差異;利用制備的膠體金試紙條和PCR方法對