抗鴨瘟病毒單克隆抗體的研制及標(biāo)準(zhǔn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)抗體的制備.pdf

1、鴨病毒性腸炎(DVE，Duck viral enteritis)，也稱(chēng)為鴨瘟(Duck plague)，是由鴨腸炎病毒(DEV，Duck Enteritis Virus)引發(fā)的會(huì)致使鴨、鵝和多種雁形目禽類(lèi)的急性、敗血性、傳染性的一種致命疾病。該病在我國(guó)屬于三類(lèi)疫病，是當(dāng)前威脅養(yǎng)鴨業(yè)進(jìn)步的重要疫病之一，其特點(diǎn)主要為傳播迅速、發(fā)病率以及死亡率高、流行廣泛。本研究制備3株針對(duì)鴨瘟病毒全病毒的單克隆抗體，初步建立抗原檢測(cè)方法。同時(shí)對(duì)DEV VA

2、C株種毒擴(kuò)增并針對(duì)其制備鴨多抗血清，通過(guò)對(duì)所制備的抗原抗體的一系列標(biāo)定后，獲取DEV的標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)血清。
　　1.抗鴨瘟病毒單克隆抗體的制備及間接免疫熒光檢測(cè)方法建立
　　本研究將DEV VAC株通過(guò)SPF鴨胚擴(kuò)增并對(duì)其進(jìn)行純化，將其作為免疫原免疫BABL/c小鼠進(jìn)行單克隆抗體的制備，采用優(yōu)化后的間接免疫熒光檢測(cè)辦法，對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行兩次篩選和四次亞克隆后，獲得三株能夠分泌DEV特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為DEV-5

3、H10、DEV-4H11、DEV-6D8，經(jīng)亞類(lèi)鑒定后判定DEV-5H10和DEV-6D8為IgG2b型單克隆抗體，DEV-4H11為IgM抗體，經(jīng)Western-blot分析后，DEV-5H10和DEV-6D8能夠與DEV VAC株反應(yīng)出現(xiàn)69KDa大小的特異性條帶，其腹水效價(jià)分別為1∶1600以及1∶3200。以單克隆抗體DEV-6D8為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，一抗、二抗孵育時(shí)間均為30min建立間接免疫熒光方法以

4、檢測(cè)病毒抗原，該方法最低可檢測(cè)到1-10個(gè)TCID50感染的細(xì)胞病毒，對(duì)臨床鴨瘟病毒的診斷具有重要意義。
　　2.鴨瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原的制備
　　本研究通過(guò)SPF鴨胚對(duì)DEV VAC株種毒進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)所收集的病毒液進(jìn)行病毒含量的測(cè)定，結(jié)果顯示該病毒液TCID50=10-48/0.1mL，通過(guò)Western-blot鑒定、中和試驗(yàn)、血凝試驗(yàn)、PCR特異性分析進(jìn)一步鑒定，表明該病毒液中無(wú)DHV（鴨病毒性肝炎）、GPV（小鵝瘟）、E

5、DS（產(chǎn)蛋下降綜合征）、IBDV（傳染性法氏囊?。?、REV（網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生）、REOV（呼腸孤病毒）、新城疫病毒(NDV)、禽流感(AIV)等外源病毒污染。通過(guò)無(wú)菌檢驗(yàn)以及支原體檢測(cè)，證明該病毒液未被細(xì)菌、支原體污染。在經(jīng)一系列標(biāo)定后的DEV全病毒抗原中添加1％ BSA凍存保護(hù)劑，對(duì)其分裝、凍干，再經(jīng)物理性狀檢查、CV值測(cè)算、均一性、穩(wěn)定性、保質(zhì)期等檢驗(yàn)后獲得DEV標(biāo)準(zhǔn)抗原。對(duì)禽類(lèi)生物制品質(zhì)量控制和效力評(píng)估具有重要的意義。
　　

6、3.鴨瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)血清的制備
　　使用DEV VAC株病毒對(duì)SPF鴨進(jìn)行免疫，制備DEV多抗血清，采用本實(shí)驗(yàn)所建立的間接免疫熒光抗體檢測(cè)辦法檢測(cè)其IFA效價(jià)為1∶27，對(duì)其進(jìn)行微量細(xì)胞中和試驗(yàn)，測(cè)算其中和效價(jià)為1∶58。利用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)以及血凝抑制試驗(yàn)鑒定該多抗血清的特異性及純異性，證明該血清只與DEV反應(yīng)而與GPV（小鵝瘟）、EDS（產(chǎn)蛋下降綜合征）、IBDV（傳染性法氏囊?。?、REV（網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生）等病毒沒(méi)有交叉反應(yīng)現(xiàn)象