兔出血癥病毒單克隆抗體的制備及標準抗原、標準血清的研制.pdf

1、兔出血癥(Rabbit hemorrhagic disease，RHD）是兔出血癥病毒(RHDV)引起的一種急性、致死性、高度接觸性傳染病。主要發(fā)病于3月齡以上的成年兔，以引起呼吸系統(tǒng)出血，實質器官出血、肝臟腫大、淤血、壞死為特點。RHDV最早于1984年爆發(fā)于中國江蘇無錫，之后蔓延全國以及全球多個國家和地區(qū)。本研究中利用桿狀病毒表達系統(tǒng)和原核表達系統(tǒng)表達RHDV-VP60分別作為免疫抗原和篩選抗原，研制了3株針對RHDV-VP60蛋白

2、的單克隆抗體，并用這些單克隆單體建立了針對RHDV-VP60的雙夾心ELISA方法;同時應用RHDV-WX84株感染非免疫成年兔，制備了RHDV抗原和多抗血清，并對抗原和抗體進行了一系列的鑒定和標定，獲得了相關標準抗原和標準血清，為RHDV的血凝和血凝抑制方法提供了有效的方法和材料。
　　1、兔出血癥病毒單克隆抗體的研制
　　參考genbank中的RHDV WX84毒株VP60的序列（登錄號:AF402614）設計針對VP6

3、0的特異性引物，利用PCR技術擴增本實驗室保存的RHDV VP60質粒。將擴增產物連接pGEX-6P-1構建重組質粒pGEX-6P-1-VP60，測序正確后，轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經IPTG誘導后，結果獲得了大小約87KD的重組蛋白GST-VP60，利用GST親和柱對重組蛋白GST-VP60進行純化。SDS-PAGE和Western-Blot結果表明，純化后的融合蛋白GST-VP60雜條帶少且具有良好的抗原性。
　　以

4、重組桿狀病毒pBlueBacHis2B-VP60感染后的sf9細胞作為免疫原，按照常規(guī)程序免疫6-8周齡Balb/c小鼠，取脾細胞與SP2/0細胞融合。利用上述重組蛋白GST-VP60包被ELISA板，進行間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(iELISA)篩選陽性細胞株，最終獲得了3株針對RHDV-VP60蛋白單克隆抗體的陽性細胞株，分別命名為:RHDV-VP60-2H6、RHDV-VP60-4H8、RHDV-VP60-6H5。Western-Blo

5、t與間接免疫熒光(IFA)鑒定結果表明，所得三株單抗均能與RHDV WX84株天然病毒發(fā)生特異性反應。亞類鑒定結果顯示RHDV-VP60-2H6株單抗為IgG1，RHDV-VP60-4H8和RHDV-VP60-6H5株單抗為IgG2a，輕鏈型均為Kappa。利用親和層系技術分別純化了3株單抗腹水，SDS-PAGE顯示獲得了高純度的單克隆抗體，為今后建立RHDV檢測方法提供了良好的生物試劑。
　　2、兔出血癥病毒雙夾心ELISA檢測

6、方法的初步建立
　　利用研究內容一已經獲得的3株針對RHDV-VP60蛋白的單克隆抗體分別進行交叉配對實驗，最終確定RHDV-VP60-2H6為捕捉抗體，RHDV-VP60-4H8E酶標抗體，建立了一種針對RHDV的雙夾心ELISA檢測方法，并對捕捉抗體和酶標抗體的工作濃度，待檢樣品和酶標抗體的最佳孵育時間，底物作用時間以及最低檢測病毒量進行了優(yōu)化，建立了兔出血癥病毒雙夾心ELISA檢測方法，該方法的建立為臨床檢測RHDV奠定了基

7、礎。
　　3、兔出血癥病毒標準抗原及標準抗體的研制
　　本研究將RHDV WX84株病毒皮下注射普通級非免疫成年兔，取病死兔肝臟進行研磨，離心取上清，經甲醛滅活后過濾、分裝，凍干。對制備的抗原進行純粹性、特異性鑒定以及血凝效價測定。結果顯示該樣本中含有RHDV抗原，不含有實驗室中常見的能凝集人O型紅細胞的NDV、AIV等病毒抗原;樣本HA效價為210。對制備抗原凍干品進行了物理性狀，計算裝量差異系數(shù)(CV)檢查，以及支原體檢

8、驗、無菌檢驗、凍干前后血凝效價、穩(wěn)定性、均一性以及長期保存等一系列特性的標定，最終研制出兔出血癥病標準陽性抗原。
　　將滅活的病毒皮下注射4只普通級非免疫成年兔，第7天任取一只，耳動脈無菌采血，分離血清，制備弱陽性血清，再用未滅活的病毒以滴鼻方式攻毒加強免疫2次，在第50天，心臟無菌采血，分離血清。制得的血清經過高嶺土和50％的人O型紅細胞處理，加入硫柳汞，分裝凍干。血凝抑制實驗結果顯示，本研究制備獲得的抗RHDV血清血凝抑制價為