腸出血性大腸桿菌O157LPS單克隆抗體的研制及其單克隆抗體免疫磁珠的制備.pdf

1、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxin-producing E.coli,STEC),又稱產(chǎn)Vero毒性大腸桿菌(Vero toxin-producing E.coli,VTEC),是一群重要的腸道致病菌。目前至少有100多種血清型的大腸桿菌具有產(chǎn)志賀毒素的能力,其中血清型為O157:H7的菌株具較高致病力。通常將人類或者家畜感染病例中分離的具有pO157質(zhì)粒、產(chǎn)生AE損傷(attaching and effacing lesion

2、)的STEC菌株統(tǒng)稱為腸出血性大腸桿菌(entero-hemorrhagic E.coli,EHEC)。
　　 腸出血性大腸桿菌(EHEC)感染性腹瀉是目前世界范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生間題之一。其中O157:H7是典型菌株,對(duì)人和家畜具有很強(qiáng)的致病力。因此,如何快速有效地對(duì)該菌進(jìn)行檢測(cè)、監(jiān)測(cè),顯得尤為重要。
　　 本研究通過EHEC O157甲醛滅活全菌免疫BALB/c小鼠,取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,利用EHEC

3、 O157、O26全菌及其通過改進(jìn)的水飽和酚法提純LPS作為篩選抗原,分別經(jīng)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(indirect enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和直接凝集試驗(yàn)(direct agglutination test)篩選,共篩選出6株雜交瘤細(xì)胞,分別命名為385,3F10,4C8,5D11,1B12,1G9。間接ELISA結(jié)果顯示:6株雜交瘤均只與EHEC O157全菌反應(yīng),而不與EHEC

4、 O26全菌反應(yīng);其中385,3F10,4C8,5D11能與EHEC O157的LPS發(fā)生反應(yīng),而不與EHEC O26的LPS發(fā)生反應(yīng)。直接凝集試驗(yàn)結(jié)果顯示:6株單抗與121℃高溫處理的EHEC O157全菌反應(yīng),但都不與EHEC O26發(fā)生反應(yīng)。選取3F10,5D11,1G9制備腹水并分別經(jīng)間接ELISA、直接凝集試驗(yàn)、Western-blot進(jìn)行鑒定。間接ELISA測(cè)得3F10,5D11,1G9對(duì)O157全菌反應(yīng)效價(jià)均為3.2×10

5、5;3F10、5D11對(duì)O157 LPS的反應(yīng)效價(jià)分別為6.4×105和1.6×105;直接凝集試驗(yàn)測(cè)得:3F10、1G9對(duì)經(jīng)121℃高溫處理的EHEC O157全菌反應(yīng)的效價(jià)分別為1:50和1:1000:Western-blot結(jié)果顯示:3F10、5D11針對(duì)EHEC O157的LPS有特異性。另外,3F10、5D11、1G9三株單抗均不與沙門氏菌,巴氏桿菌,非O157菌株等發(fā)生交叉反應(yīng),表明上述單抗具有良好的特異性。三株單抗經(jīng)亞類鑒

6、定均為IgM。
　　 將單抗3F10通過優(yōu)球蛋白沉淀法進(jìn)行初步提純,提純后的蛋白濃度為:8.2mg/mL。將3F10包被聚苯乙烯磁珠,通過BCA蛋白定量試劑盒結(jié)合酶標(biāo)儀檢測(cè)偶聯(lián)反應(yīng)前后的抗體含量,計(jì)算出包被后的磁珠表面抗體量平均為62.6μg/mg。通過CFU計(jì)數(shù)該磁珠集菌前后水樣中EHEC O157菌數(shù),計(jì)算出該磁珠的吸附率為54.7％。該磁珠富集目的菌效果良好,并可去除樣品中PCR反應(yīng)抑制成分。模擬糞便樣品經(jīng)免疫磁珠集菌后直