腸出血性大腸桿菌O157-H7單克隆抗體及膠體金免疫層析試紙條的研制.pdf

1、腸出血性大腸桿菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7是一種重要的食源性病原菌,1982年該菌首先在美國被發(fā)現,此后在世界各地散發(fā)或地方流行。該菌感染可引起出血性或非出血性腹瀉、出血性結腸炎(HC)、溶血性尿毒綜合征(HUS)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)等全身性并發(fā)癥。
　　 反芻動物是EHEC O157:H7的主要貯存宿主,國內外均有從牛羊等動物的糞便中分離到該

2、菌的報道,目前普遍認為受污染的環(huán)境、食物和水源是本病的主要傳播媒介。建立和完善動物性食品及環(huán)境中EHEC O157:H7的檢測手段,是進行流行病學調查以及該病防控的關鍵問題之一。雖然分離培養(yǎng)鑒定仍是檢測EHECO157:H7的金標準,但通常需要數天才能得到結果,不能滿足快速診斷的需要。分子生物學和免疫學方法因具有特異、敏感、快速等特點在EHEC O157:H7檢測和診斷中發(fā)揮著愈來愈重要的作用。
　　 研究一:將E.coli O

3、157:H7用甲醛滅活,免疫BAILB/c小鼠,制備免疫脾細胞,與SP2/0骨髓瘤細胞融合,建立了5株能穩(wěn)定分泌抗E.coli O157:H7單克隆抗體的雜交瘤細胞株,分別命名為1B1、2D6、2D9、2E3和2G5。其中2G5的Ig亞類為IgG3,其余四株均為IgM,輕鏈均為κ型,腹水抗體ELISA效價分別為1×105、1×104、1×106、1×107、1×107,凝集試驗顯示五株單抗與EHEC O26:H11、EHEC O111等

4、其他受試菌株均不反應,具有良好的特異性。
　　 研究二:采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金,用純化的單克隆抗體2G5標記,制備金標抗體玻璃纖維素膜;將純化的2E3固定于硝酸纖維素膜(NC)上作為捕獲抗體;組裝成雙抗夾心法O157:H7膠體金免疫層析檢測試紙條。用該試紙條可特異檢測O157:H7,敏感度為106CFU/ml,在1～5 min內可得出檢測結果,與EHECO26:H11、EHEC O111等其他受試菌株均不反應;敏感性高,

5、特異性強,便于O157:H7的臨床快速診斷與現場檢測樣品的快速篩查。
　　 研究三:采用灌胃攻毒方式,使小鼠感染O157:H7,用大腸桿菌O157檢測試紙條與O157:H7鑒別培養(yǎng)基細菌培養(yǎng)計數兩種方法檢測感染小鼠糞便中的O157:H7的排菌量和排菌持續(xù)時間。結果顯示小鼠在感染O157:H7后2h開始糞便排菌,6h達到峰值,排菌時間最長可持續(xù)15d。大腸桿菌O157檢測試紙條與O157:H7鑒別培養(yǎng)基細菌培養(yǎng)計數兩種方法的檢測結