腸出血性大腸桿菌O157-H7z3672基因的敲除與毒力評價.pdf

1、病原微生物的流行對人類健康構成了重大威脅，研究病原微生物與宿主相互作用的分子基礎，對預防與治療感染性疾病、改善人類健康具有重要意義，它也一直是醫(yī)學界面臨的重要課題之一。生物信息學作為一門新興學科已廣泛地滲透到生命科學的各個研究領域，發(fā)揮著巨大作用。隨著越來越多的全基因組序列的測定完成，對基因組序列進行比較分析，探索序列結構與病原微生物致病能力間關系的比較基因組學也應運而生，為病原微生物學的研究注入了新的活力。在前期研究中，我們應用生物信

2、息學技術預測發(fā)現(xiàn)了一個新的蛋白家族(FlxA-likeproteins)，分析表明該蛋白家族可能參與細菌與宿主相互作用，并且可能是具有Ⅲ型分泌系統(tǒng)的致病菌的重要效應蛋白(毒力蛋白)。
　　 腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E.coli，EHEC)O157：H7是常見的腸道致病菌，感染該菌可引起腹瀉、出血性結腸炎，溶血性尿毒綜合征及血栓形成性血小板減少性紫癜等嚴重并發(fā)癥，嚴重者可導致死亡，致死率達5％～10％

3、。1982年，Riley等報道了由O157：H7引起的出血性結腸炎的暴發(fā)流行，這也是把O157：H7確認為嚴重致病菌的首次報道。隨后在加拿大、日本、英國、澳大利亞等地發(fā)生了多起該菌的感染流行。1999年，在我國安徽、江蘇兩省曾暴發(fā)流行O157感染性腹瀉，患者超過2萬人，死亡177人，流行時間7個月，可能是迄今為止世界上流行規(guī)模最大的一次。我國已將EHEC列為21世紀可能對國人衛(wèi)生健康有重大影響的12種病原微生物之一。由于O157：H7的

4、感染呈現(xiàn)暴發(fā)流行趨勢，感染后對人體有強烈的致病性與致死性，而且抗生素治療可能會加劇病情，因此，它已經成為全球性的公共衛(wèi)生問題。O157培養(yǎng)容易、傳播途徑多樣，感染性很強，<100 CFU(菌落形成單位)即可致病，且多數(shù)病癥較為嚴重。它也被美國疾病控制中心(CDC)列為B類生物恐怖病原體嚴加防范。通過近三十多年的研究，我們對O157：H7的致病機制已經有了初步認識，但尚未完全闡明，了解感染的致病機理對預防和治療由該菌引起的流行性疾病具有重

5、要的理論指導意義。
　　 我們應用生物信息學技術預測發(fā)現(xiàn)的新蛋白家族(FlxA-like proteins)成員中存在Z3672蛋白，它是一個來源于O157：H7的假想蛋白，根據(jù)預測信息我們推測它很可能是具有Ⅲ型分泌系統(tǒng)的致病菌重要的效應蛋白(毒力蛋白)。因此，通過對O157：H7 Z3672蛋白的研究，有望發(fā)現(xiàn)一個新的Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應分子，從而推進O157：H7致病的分子基礎研究工作，為進一步了解FlxA-like蛋白家族在細

6、菌與宿主相互作用過程中所發(fā)揮的功能奠定基礎。
　　 本研究通過Red重組系統(tǒng)成功構建了O157：H7z3672缺失突變株。首先經過PCR、酶切、連接等步驟，構建了兩端同源序列分別約500bp的z3672基因長同源臂打靶片段，該片段連接在pET-24a載體上。然后通過pKOBEG質粒介導的Red重組，使電擊轉化入菌體內部的同源臂打靶片段與O157：H7基因組序列進行了同源重組，經過抗性篩選、PCR鑒定以及測序分析，成功獲得了O15

7、7：H7z3672缺失突變體。通過Real-Time PCR實驗，針對z3672基因在野生株是否轉錄進行了檢測，比較O157：H7野生株與O157：H7z3672缺失突變株中z3672基因的轉錄差異，并且證明了在O157：H7野生株中z3672基因存在轉錄活性。
　　 在獲得了O157：H7z3672缺失突變株后，主要對z3672基因的功能進行了初步研究。一方面，利用雙向電泳以及蛋白質譜鑒定的方法，對O157：H7野生株和O15

8、7：H7z3672缺失突變株進行了蛋白質組學分析。研究表明，在O157：H7z3672缺失突變株中，外膜蛋白A(OmpA)的表達量升高。通過Real-Time PCR實驗從基因的轉錄水平對以上實驗結果進行了驗證。結果證明，Real-Time PCR與雙向電泳結果一致，因此，在O157：H7中，z3672基因與ompA(外膜蛋白A)基因存在某種聯(lián)系，敲除Z3672基因可以提高外膜蛋白A的表達水平。另一方面，通過體外細胞實驗，比較O157：

9、H7野生株與O157：H7z3672缺失突變株對真核細胞(HeLa)造成的A/E損傷是否存在差異。利用細胞骨架蛋白的免疫熒光實驗，觀察O157：H7野生株與O157：H7z3672缺失突變株分別粘附HeLa細胞后，細胞骨架蛋白Actin，Keratin，Tubulin改變差異。實驗表明，敲除z3672基因前后，O157：H7對細胞骨架蛋白Actin，Keratin，Tubulm改變差異并不明顯。這也說明，Z3672蛋白不是O157：H7

10、中影響真核細胞骨架改變的核心因子。
　　 在細胞骨架肌動蛋白熒光染色實驗中發(fā)現(xiàn)：利用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)的O157：H7感染HeLa細胞后可以形成明顯的肌動蛋白聚集現(xiàn)象。于是對這一現(xiàn)象進行了初步探索。利用不同的培養(yǎng)基條件(LB，DMEM，DMEM含10％FBS，DMEM含終濃度為25m mol/L HEPES)培養(yǎng)O157：H7并對其生長狀態(tài)，粘附HeLa細胞，HeLa細胞骨架肌動蛋白聚集狀況以及蛋白表達情況進行了初步分

11、析。結果表明，雖然在DMEM含10％FBS中生長最慢，但是O157：H7粘附性以及對肌動蛋白聚集的能力是最強的。由于O157：H7對真核細胞的A/E損傷主要表現(xiàn)在兩個方面，一是其對真核細胞的粘附作用；二是其對真核細胞的細胞骨架肌動蛋白聚集能力。因此，以上的實驗結果也說明了利用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的O157：H7對真核細胞的A/E損傷能力增強，進而其致病能力也增強了。
　　 本研究構建了O157：H7z3672缺失突