腸出血性大腸桿菌O157-H7z3672基因的敲除與毒力評價.pdf

1、病原微生物的流行對人類健康構(gòu)成了重大威脅，研究病原微生物與宿主相互作用的分子基礎(chǔ)，對預(yù)防與治療感染性疾病、改善人類健康具有重要意義，它也一直是醫(yī)學(xué)界面臨的重要課題之一。生物信息學(xué)作為一門新興學(xué)科已廣泛地滲透到生命科學(xué)的各個研究領(lǐng)域，發(fā)揮著巨大作用。隨著越來越多的全基因組序列的測定完成，對基因組序列進行比較分析，探索序列結(jié)構(gòu)與病原微生物致病能力間關(guān)系的比較基因組學(xué)也應(yīng)運而生，為病原微生物學(xué)的研究注入了新的活力。在前期研究中，我們應(yīng)用生物信

2、息學(xué)技術(shù)預(yù)測發(fā)現(xiàn)了一個新的蛋白家族(FlxA-likeproteins)，分析表明該蛋白家族可能參與細菌與宿主相互作用，并且可能是具有Ⅲ型分泌系統(tǒng)的致病菌的重要效應(yīng)蛋白(毒力蛋白)。
　　 腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E.coli，EHEC)O157：H7是常見的腸道致病菌，感染該菌可引起腹瀉、出血性結(jié)腸炎，溶血性尿毒綜合征及血栓形成性血小板減少性紫癜等嚴重并發(fā)癥，嚴重者可導(dǎo)致死亡，致死率達5％～10％

3、。1982年，Riley等報道了由O157：H7引起的出血性結(jié)腸炎的暴發(fā)流行，這也是把O157：H7確認為嚴重致病菌的首次報道。隨后在加拿大、日本、英國、澳大利亞等地發(fā)生了多起該菌的感染流行。1999年，在我國安徽、江蘇兩省曾暴發(fā)流行O157感染性腹瀉，患者超過2萬人，死亡177人，流行時間7個月，可能是迄今為止世界上流行規(guī)模最大的一次。我國已將EHEC列為21世紀可能對國人衛(wèi)生健康有重大影響的12種病原微生物之一。由于O157：H7的

4、感染呈現(xiàn)暴發(fā)流行趨勢，感染后對人體有強烈的致病性與致死性，而且抗生素治療可能會加劇病情，因此，它已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題。O157培養(yǎng)容易、傳播途徑多樣，感染性很強，<100 CFU(菌落形成單位)即可致病，且多數(shù)病癥較為嚴重。它也被美國疾病控制中心(CDC)列為B類生物恐怖病原體嚴加防范。通過近三十多年的研究，我們對O157：H7的致病機制已經(jīng)有了初步認識，但尚未完全闡明，了解感染的致病機理對預(yù)防和治療由該菌引起的流行性疾病具有重

5、要的理論指導(dǎo)意義。
　　 我們應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測發(fā)現(xiàn)的新蛋白家族(FlxA-like proteins)成員中存在Z3672蛋白，它是一個來源于O157：H7的假想蛋白，根據(jù)預(yù)測信息我們推測它很可能是具有Ⅲ型分泌系統(tǒng)的致病菌重要的效應(yīng)蛋白(毒力蛋白)。因此，通過對O157：H7 Z3672蛋白的研究，有望發(fā)現(xiàn)一個新的Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)分子，從而推進O157：H7致病的分子基礎(chǔ)研究工作，為進一步了解FlxA-like蛋白家族在細

6、菌與宿主相互作用過程中所發(fā)揮的功能奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究通過Red重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了O157：H7z3672缺失突變株。首先經(jīng)過PCR、酶切、連接等步驟，構(gòu)建了兩端同源序列分別約500bp的z3672基因長同源臂打靶片段，該片段連接在pET-24a載體上。然后通過pKOBEG質(zhì)粒介導(dǎo)的Red重組，使電擊轉(zhuǎn)化入菌體內(nèi)部的同源臂打靶片段與O157：H7基因組序列進行了同源重組，經(jīng)過抗性篩選、PCR鑒定以及測序分析，成功獲得了O15

7、7：H7z3672缺失突變體。通過Real-Time PCR實驗，針對z3672基因在野生株是否轉(zhuǎn)錄進行了檢測，比較O157：H7野生株與O157：H7z3672缺失突變株中z3672基因的轉(zhuǎn)錄差異，并且證明了在O157：H7野生株中z3672基因存在轉(zhuǎn)錄活性。
　　 在獲得了O157：H7z3672缺失突變株后，主要對z3672基因的功能進行了初步研究。一方面，利用雙向電泳以及蛋白質(zhì)譜鑒定的方法，對O157：H7野生株和O15

8、7：H7z3672缺失突變株進行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析。研究表明，在O157：H7z3672缺失突變株中，外膜蛋白A(OmpA)的表達量升高。通過Real-Time PCR實驗從基因的轉(zhuǎn)錄水平對以上實驗結(jié)果進行了驗證。結(jié)果證明，Real-Time PCR與雙向電泳結(jié)果一致，因此，在O157：H7中，z3672基因與ompA(外膜蛋白A)基因存在某種聯(lián)系，敲除Z3672基因可以提高外膜蛋白A的表達水平。另一方面，通過體外細胞實驗，比較O157：

9、H7野生株與O157：H7z3672缺失突變株對真核細胞(HeLa)造成的A/E損傷是否存在差異。利用細胞骨架蛋白的免疫熒光實驗，觀察O157：H7野生株與O157：H7z3672缺失突變株分別粘附HeLa細胞后，細胞骨架蛋白Actin，Keratin，Tubulin改變差異。實驗表明，敲除z3672基因前后，O157：H7對細胞骨架蛋白Actin，Keratin，Tubulm改變差異并不明顯。這也說明，Z3672蛋白不是O157：H7

10、中影響真核細胞骨架改變的核心因子。
　　 在細胞骨架肌動蛋白熒光染色實驗中發(fā)現(xiàn)：利用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)的O157：H7感染HeLa細胞后可以形成明顯的肌動蛋白聚集現(xiàn)象。于是對這一現(xiàn)象進行了初步探索。利用不同的培養(yǎng)基條件(LB，DMEM，DMEM含10％FBS，DMEM含終濃度為25m mol/L HEPES)培養(yǎng)O157：H7并對其生長狀態(tài)，粘附HeLa細胞，HeLa細胞骨架肌動蛋白聚集狀況以及蛋白表達情況進行了初步分

11、析。結(jié)果表明，雖然在DMEM含10％FBS中生長最慢，但是O157：H7粘附性以及對肌動蛋白聚集的能力是最強的。由于O157：H7對真核細胞的A/E損傷主要表現(xiàn)在兩個方面，一是其對真核細胞的粘附作用；二是其對真核細胞的細胞骨架肌動蛋白聚集能力。因此，以上的實驗結(jié)果也說明了利用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的O157：H7對真核細胞的A/E損傷能力增強，進而其致病能力也增強了。
　　 本研究構(gòu)建了O157：H7z3672缺失突