腸出血性大腸桿菌O157-H7膠體金免疫檢測(cè)試紙條的制備.pdf

1、食源性病原微生物是當(dāng)今食品安全和突發(fā)性公共衛(wèi)生事件的主要誘因，在食源性病原微生物中，腸出血性大腸桿菌(EHEC) O157∶H7是重要的病原之一。本實(shí)驗(yàn)旨在制備抗O157∶H7特異單克隆抗體，建立O157∶H7膠體金免疫層析檢測(cè)方法，為臨床快速診斷以及帶菌動(dòng)物、環(huán)境污染物和食品等現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)樣品的快速篩查提供簡便快速的檢測(cè)手段。
　　 研究內(nèi)容分為三個(gè)部分:
　　 1.分泌抗大腸桿菌O157∶H7單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立

2、
　　 將E.coli O157∶H7用甲醛滅活超聲破碎，免疫BALB/c鼠，制備免疫脾細(xì)胞，與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，建立了7株分泌抗E.coli O157∶H7單克隆抗體(mAbs)的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2E7、2F5、1G9、1D3、2H7、2G11和1C3，Ig亞類分別是IgG2bκ、IgG2aκ、IgMκ、Ⅰ IgMκ、IgG2bκ、IgMκ和IgG2aκ。用間接ELISA檢測(cè)，1G9和2G11細(xì)胞培養(yǎng)上清液的效

3、價(jià)為1.6×103，腹水效價(jià)均為1×1011;1C3、2E7、2F5、1D3和2H7細(xì)胞培養(yǎng)上清液的效價(jià)為1×101～2×102，腹水效價(jià)均為4×102～1×106。相加ELISA結(jié)果顯示，1D3和2H7 mAbs對(duì)應(yīng)相同的抗原表位，而其它五株對(duì)應(yīng)不同的抗原表位。用間接ELISA分析特異性，2E7、2H7和1D3為抗EHECO157∶H7特異性單克隆抗體，其它四株mAbs與某些其他血清型的大腸桿菌有交叉反應(yīng)。Western blotti

4、ng表明，1C3、1G9、2G11、2E7、1D3和2H7六株mAbs在蛋白分子量約35kD處有特異性條帶，而mAbs2F5則未顯示蛋白帶。
　　 2.大腸桿菌O157∶H7單克隆抗體膠體金免疫檢測(cè)試紙條的研制
　　 采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，用純化的單克隆抗體2E7標(biāo)記，制備金標(biāo)抗體玻璃纖維素膜;將純化的2H7和羊抗鼠IgG分別作為檢測(cè)和對(duì)照捕捉抗體包被于硝酸纖維素膜(NC)上;組裝成雙抗夾心法O157∶H7

5、膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條。用該試紙條可特異檢測(cè)EHECO157∶H7，敏感度為106CFU/ml，與相同單克隆抗體2H7和2E7建立的O157∶H7夾心ELISA檢測(cè)方法的敏感度相當(dāng)，試紙條簡便快速，在1～5 min內(nèi)可得出檢測(cè)結(jié)果，與EHEC O26∶H11、EHEC O111等其他受試菌株均不反應(yīng);敏感性高，特異性強(qiáng)，便于O157∶H7的臨床快速診斷與現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)樣品的快速篩查。
　　 3.大腸桿菌O157∶H7膠體金免疫檢測(cè)試

6、紙條在感染牛和小鼠排菌檢測(cè)中的應(yīng)用
　　 為了檢驗(yàn)大腸桿菌O157∶H7膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條在感染動(dòng)物排菌中的應(yīng)用效果，將牛和小鼠采用灌胃攻毒方式實(shí)驗(yàn)感染大腸桿菌O157∶H7，用大腸桿菌O157∶H7膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條、細(xì)菌鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)以及PCR3種方法檢測(cè)感染動(dòng)物糞便中的O157∶H7的排菌量和持續(xù)時(shí)間。牛在感染大腸桿菌O157∶H7后的第2d開始從糞便排菌，第4d達(dá)到峰值，排菌時(shí)間可持續(xù)28d;小鼠在感染O15