腸出血性大腸桿菌O157-H7適配體的篩選及初步應(yīng)用研究.pdf

1、腸出血性大腸桿菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7，E.coli O157:H7）是與公共衛(wèi)生有關(guān)的重要的食源性致病菌，對(duì)公眾的健康造成了巨大的威脅，實(shí)現(xiàn)對(duì)其準(zhǔn)確快速的檢測(cè)至關(guān)重要。利用指數(shù)級(jí)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)，從人工合成的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選得到的一段單鏈DNA或RNA片

2、段稱為適配體（aptamer）。適配體能夠形成特定的結(jié)構(gòu)，與靶物質(zhì)高特異性、高親和力地結(jié)合，因此可以作為高靈敏度以及高特異性的識(shí)別元件應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域的檢測(cè)系統(tǒng)。
　　本研究采用消減（subtractive）Cell-SELEX技術(shù)，篩選獲得了特異性識(shí)別E.coli O157:H7單鏈DNA(ssDNA)適配體，并且進(jìn)一步結(jié)合納米磁顆粒建立了水樣和食品中E.coli O157:H7的新型檢測(cè)方法。體外合成中間隨機(jī)序列為45個(gè)堿基，全

3、長(zhǎng)88個(gè)堿基的單鏈DNA文庫(kù)；以E.coli O157:H7為靶細(xì)菌，利用消減CELL-SELEX技術(shù)經(jīng)過(guò)7輪重復(fù)篩選，挑選出與靶細(xì)胞結(jié)合效率最高的第六輪篩選結(jié)合子進(jìn)行克隆測(cè)序。應(yīng)用軟件Chromas和DNAMAN對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行家族同源性分析和模擬二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，篩選出具有代表性的序列人工合成并標(biāo)記異硫氰酸熒光素（FITC），使用熒光化學(xué)分析儀、流式細(xì)胞儀以及激光共聚焦顯微鏡對(duì)適配體進(jìn)行親和性與特異性測(cè)定。篩選得到1條與E.coli O

4、157:H7特異性結(jié)合的適配體A46，其解離常數(shù)Kd值為82.45±18.46nM（nmol/L）。其次，將適配體A46進(jìn)行生物素化修飾，然后與鏈霉親和素包被的納米磁顆粒結(jié)合，以此作為捕獲探針，以熒光FITC標(biāo)記的適配體A46作為熒光探針，構(gòu)建了大腸桿菌O157:H7的實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用方法。在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，E.coli O157:H7檢測(cè)的線性范圍是90～5×104cfu/ml，最低檢出濃度是88cfu/ml，實(shí)際水樣中加標(biāo)檢測(cè)率最高為