基于腸出血性大腸桿菌EHEC O157：H7 EspA的高效融合表達(dá)載體的設(shè)計(jì)、構(gòu)建及應(yīng)用研究.pdf

1、在生命科學(xué)研究和生物制藥、生物制品的生產(chǎn)中，利用表達(dá)載體制備重組蛋白是重要而關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，獲得足夠量的重組蛋白是進(jìn)行后續(xù)研究和生產(chǎn)的必要條件。構(gòu)建有效的表達(dá)載體是表達(dá)目的基因的基本要求，同時(shí)也是影響基因表達(dá)水平以及蛋白活性的重要因素。目前有許多商業(yè)化的表達(dá)載體可用于重組蛋白的表達(dá)、生產(chǎn)及后續(xù)研究，然而，缺乏具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高效、穩(wěn)定、低成本、易純化的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)是目前基因工程藥物/疫苗研發(fā)、生產(chǎn)和相關(guān)生物技術(shù)的瓶頸之一。 腸

2、出血性大腸桿菌0157:H7分泌蛋白A(Escherichia coli secret protein A，EspA)為III型分泌系統(tǒng)的重要元件，不僅在細(xì)菌黏附過程中發(fā)揮關(guān)鍵性的啟動(dòng)作用，也在形成A/E損傷的效應(yīng)分子傳遞中起到橋梁作用。EspA是一種外膜蛋白，具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，研究表明EspA可作為疫苗研究的候選抗原。我們?cè)谶M(jìn)行EHEC0157:H7亞單位疫苗研究的過程中發(fā)現(xiàn)EspA在大腸桿菌工程菌中易于高效表達(dá)，表達(dá)量

3、可達(dá)到40％。此外，還發(fā)現(xiàn)Stx2Al亞單位在很多原核表達(dá)載體中[pET-22b(+)，pQE-30，pET-28a(+)]都不表達(dá)，而與EspA融合后以融合蛋白的形式獲得表達(dá)。因此，我們推測(cè)EspA是否具有促使原核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)外源目的蛋白的功能，使本身不表達(dá)或表達(dá)量低的目的蛋白得到高效表達(dá)。 有鑒于此，本研究擬構(gòu)建基于EspA的高效原核融合表達(dá)載體pEspA，并驗(yàn)證此載體的通用性。pEspA的構(gòu)建不僅方便EHEC0157:

4、 H7基因工程多亞單位融和蛋白疫苗的研究，也為構(gòu)建具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高效、穩(wěn)定、低成本、易純化的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。 方法: 1.高效原核融合表達(dá)載體pEspA的設(shè)計(jì)及構(gòu)建 PCR擴(kuò)增EHEC0157:H7 espA基因，同時(shí)在其C端設(shè)計(jì)- Linker，包括柔韌區(qū)、腸激酶切割位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)。利用重疊延伸的方法將espA和Linker基因融合，通過基因重組技術(shù)連接至pET-28a(+)載體構(gòu)建基于Esp

5、A的融合表達(dá)載體pEspA。1mmol/L IPTG，37℃條件下誘導(dǎo)EspA蛋白表達(dá)。12％SDS-PAGE測(cè)定是否有目的蛋白表達(dá)。并以EspA單克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，進(jìn)行蛋白的免疫印跡檢測(cè)。 2.pEspA載體通用性研究 2.1選擇Stx2Al(腸出血性大腸桿菌0157:H7 Stx2毒素Al亞單位)、IL-24、Stx2B(腸出血性大腸桿菌0157:H7 Stx2毒素B亞單位)、GF

6、P(綠色熒光蛋白)、Sl(百日咳毒素S1亞單位)、intinunC300(腸出血性大腸桿菌0157:H7緊密黏附素C-端免疫保護(hù)性片段)6種外源蛋白作為pEspA載體功能驗(yàn)證的目的蛋白。通過基因工程常規(guī)方法將6種外源基因克隆入pEspA載體后，以不同濃度的IPTG(0.1、0.2、0.5、1mM)在不同溫度條件下(37℃、25℃、16℃)誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)，12％SDS-PAGE鑒定融合蛋白的表達(dá)量，選擇最佳誘導(dǎo)條件。以EspA單克隆抗

7、體作為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，進(jìn)行融合蛋白的免疫印跡檢測(cè)。誘導(dǎo)后的重組工程菌超聲破菌后分別取上清和沉淀進(jìn)行12％SDS-PAGE，鑒定目的蛋白的表達(dá)形式。 2.2利用腸激酶切去融合蛋白中的EspA融合蛋白EspA-IL-24和EspA-GFP經(jīng)親和層析純化后，將pH值調(diào)整為7.0-8.0進(jìn)行腸激酶酶切實(shí)驗(yàn)，酶切后樣品離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。 3.融合蛋白EspA- Stx2Al生物學(xué)活性鑒定

8、 3.1融合蛋白EspA- Stx2Al的復(fù)性和純化 經(jīng)親和層析柱對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化后，利用瞬間稀釋法對(duì)融合蛋白進(jìn)行復(fù)性。取純化后的融合蛋白進(jìn)行12％SDS-PAGE分析目的蛋白的純化效果。Western blot檢測(cè)融合蛋白與EspA單抗和Stx2Al單抗的免疫反應(yīng)性。 3.2融合蛋白的免疫原性檢測(cè) 選用4-5周齡的Balb/c小鼠，將純化的融合蛋白與弗氏完全佐劑混合研磨成油包水樣，免疫小鼠，抗原量與佐

9、劑量均為100ug/只。采用如下免疫程序：免疫時(shí)間為0、1、2周，共3次，每次在小鼠腹部及腹股溝皮下注射總體積0.2ml的相應(yīng)抗原和佐劑，以PBS為陰性對(duì)照。常規(guī)ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中特異性針對(duì)EspA和Stx2Al抗體的滴度。 3.3免疫小鼠的攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn) 選用4-5周齡Balb/c小鼠，隨機(jī)分為EspA-Stx2Al免疫組、EspA免疫組和PBS對(duì)照組?？乖颗c佐劑量均為100ug/只，免疫時(shí)間為0、1、2周，

10、共3次。各組均于末次免疫14d后以Stx2毒素絕對(duì)致死劑量(LDioo)，總蛋白50ug/ml注入小鼠腹腔進(jìn)行攻毒。兩周觀察期結(jié)束時(shí)計(jì)算實(shí)驗(yàn)小鼠的死亡數(shù)與存活率。 3.4融合蛋白免疫小鼠血清的中和作用 將Stx2毒素稀釋到能夠殺死70％ HeLa細(xì)胞后先與EspA-stx2Al融合蛋白抗血清(或EspA抗血清)于37℃、5％CO2共同孵育1h，再將此混合物加入到HeLa細(xì)胞中37℃、5％CO2繼續(xù)孵育3天，利用MTT法檢

11、測(cè)小鼠血清的中和活性。 3.5 FAS(Fluorescent actin staining) 通過FAS試驗(yàn)檢測(cè)融合蛋白抗血清阻止0157:H7菌與HeLa細(xì)胞間粘附和擦拭性(attaching and effacing，A/E)損傷的效果。 結(jié)果: 1.重組質(zhì)粒pEspA經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功，pEspA/BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，12％SDS-PAGE檢測(cè)，可見在25kDa附近出現(xiàn)一

12、條新的蛋白表達(dá)條帶。免疫印跡結(jié)果顯示pEspA在工程菌中能表達(dá)EspA，說明Linker的插入沒有影響EspA的表達(dá)。 2.6種外源基因克隆至載體pEspA，構(gòu)建含有相應(yīng)融合基因的重組工程菌，實(shí)驗(yàn)證明融合蛋白的最佳誘導(dǎo)條件為1mmol/L的IPTG在25℃條件下誘導(dǎo)8小時(shí)。以EspA單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡，結(jié)果顯示高效表達(dá)了EspA與六種外源基因的融合蛋白。改變誘導(dǎo)劑濃度對(duì)6種融合蛋白的表達(dá)形式均未產(chǎn)生影響。降低誘導(dǎo)溫度對(duì)Esp

13、A-GFP、EspA-Stx2B、EspA-intiminC300三種融合蛋白的可溶性表達(dá)具有一定的促進(jìn)作用，而降低誘導(dǎo)溫度未促進(jìn)融合蛋白EspA-S1、EspA-IL-24、EspA-Stx2Al的可溶性表達(dá)。融合蛋白EspA-GFP、EspA-IL-24經(jīng)腸激酶酶切后，經(jīng)SDS-PAGE均可檢測(cè)到目的蛋白條帶，提示酶切成功；大部分GFP、IL-24仍以可溶形式存在于酶切蛋白液中，這一結(jié)果說明EspA的去除并未導(dǎo)致GFP、IL-24產(chǎn)

14、生沉淀。 3.EspA-Stx2Al包涵體經(jīng)洗滌、溶解后利用親和層析柱進(jìn)行純化，純度可達(dá)90％，1L重組工程菌菌液中可獲得120mg的融合蛋白。融合蛋白復(fù)性后，1L重組工程菌菌液中可獲得30mg的融合蛋白。Western blot結(jié)果顯示，重組融合蛋白EspA-Stx2Al與EspA和Stx2Al單克隆抗體均具有免疫反應(yīng)性。ELISA結(jié)果顯示融合蛋白具有良好的免疫原性，可刺激小鼠產(chǎn)生分別針對(duì)EspA和Stx2Al的特異性抗體。融

15、合蛋白免疫小鼠能夠抵御致死劑量Stx2毒素攻擊，免疫Balb/c小鼠后血清特異性抗體可以中和Stx2毒素，抗血清濃度為0.04ug/ml時(shí)，抑制率達(dá)到50％-60％。FAS結(jié)果表明融合蛋白抗血清不能阻斷0157:H7菌對(duì)HeLa細(xì)胞的黏附，但能夠阻斷HeLa細(xì)胞肌蛋白的聚集，這說明融合蛋白抗血清在抑制A/E損傷過程中起到重要作用。 結(jié)論: 1.成功構(gòu)建了基于EspA的高效原核融合表達(dá)載體pEspA，此載體具有以下特征：①

16、含有T7啟動(dòng)子、卡那霉素抗性基因以及6個(gè)連續(xù)組氨酸純化標(biāo)簽(6xHis tag)。②espA的羧基端設(shè)計(jì)了一段Linker，包括柔韌區(qū)、腸激酶酶切位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)。柔韌區(qū)為EspA和外源蛋白提供了過渡，減少二者在空間結(jié)構(gòu)上的相互干擾及可能出現(xiàn)的一些剛性結(jié)構(gòu)；腸激酶切割位點(diǎn)的設(shè)計(jì)方便將EspA從融合蛋白中切除；6個(gè)多克隆位點(diǎn)均為基因工程常用酶切位點(diǎn)，為外源基因的插入提供方便。 2.利用6種外源基因?qū)d體通用性進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明E

17、spA可促進(jìn)原核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)外源目的蛋白，使本身不表達(dá)或表達(dá)量低的目的蛋白得到高效表達(dá)，也可使表達(dá)的蛋白進(jìn)一步提高表達(dá)量，此外，EspA對(duì)一些外源蛋白的可溶性表達(dá)具有一定的促進(jìn)作用。融合蛋白EspA-GFP純化后在紫外光下呈現(xiàn)綠色熒光，表明GFP與EspA融合后仍保持原有的生物學(xué)活性；腸激酶酶切實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示EspA從融合蛋白EspA-GFP、EspA-IL-24中去除并未使目的蛋白產(chǎn)生沉淀。 3.利用此系統(tǒng)表達(dá)的融合蛋白Es