腸出血性大腸埃希菌O157：H7緊密黏附素的基因克隆、表達(dá)及功能初步研究.pdf

1、一、研究背景和目的 腸出血性大腸埃希菌（Enterohaemorrhagic E.coli，EHEC）O157：H7是一種新現(xiàn)腸道致病菌，能引起人出血性腸炎（Hemorrhagic colitis，HC）、溶血性尿毒綜合征（Hemolytic uremic syndrome，HUS）和血栓性血小板減少性紫癜（Thrombotic thromobocytopenie porpura，TTP）等。1982年在美國(guó)密執(zhí)安州和俄勒岡州，

2、Riley等報(bào)道了因食漢堡包引起的食物中毒事件，最后確認(rèn)病原菌是EHEC O157：H7。隨后世界各地均有發(fā)生EHEC O157：H7流行。美國(guó)于1993年發(fā)生了一次涉及到4個(gè)州700余名兒童的EHEC O157：H7暴發(fā)，其中51例發(fā)生了HUS，4例死亡。1996年5-8月在日本發(fā)生了一起涉及30多個(gè)縣市的的EHEC O157：H7暴發(fā)流行，患者9000余名，死亡9人。1999-2000年我國(guó)蘇皖等地發(fā)生的EHEC O157：H7大規(guī)

3、模暴發(fā)流行，患者約2萬(wàn)人，發(fā)生急性腎功能衰竭者195人，死亡人數(shù)177人，可能是迄今為止世界上流行規(guī)模最大、死亡人數(shù)最多、流行時(shí)間最長(zhǎng)、發(fā)病原因最復(fù)雜的一次。EHEC O157：H7的感染呈暴發(fā)流行趨勢(shì)，具有強(qiáng)烈的致病性與致死性，已成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。 EHEC O157：H7致病性相關(guān)的毒力因子有緊密黏附素（Intimin）、志賀毒素1型、2型（Shiga toxin，Stx1、Stx2）和溶血素（Haemolysin，

4、Hly）等。EHEC O157：H7的致病作用主要通過(guò)細(xì)菌對(duì)腸黏膜上皮細(xì)胞黏附和產(chǎn)生毒素兩個(gè)過(guò)程。EHECO157：H7侵入機(jī)體后，通過(guò)菌毛局限性地黏附在盲腸和結(jié)腸上皮細(xì)胞的刷狀緣上并損害微絨毛，此后細(xì)菌染色體LEE（Locus of enterocyte effacement）毒力島上的eae基因編碼的Intimin介導(dǎo)細(xì)菌緊密黏附在腸上皮細(xì)胞膜上，導(dǎo)致在腸上皮細(xì)胞與細(xì)菌接觸處的鄰近部位肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白等積聚，形成墊狀結(jié)構(gòu)，這種損害

5、被稱(chēng)為黏附-抹去（Attaching and effacing lesion，A/E lesion）損傷。在EHEC O157：H7特征性A/E損傷的發(fā)生過(guò)程中，Intimin起非常重要的作用，有研究表明Intimin是EHEC O157：H7在人腸道粘膜定居并引起A/E損傷所必需。Tzipoai等使染色體上eae基因突變致EHEC O157：H7不能黏附到上皮細(xì)胞，當(dāng)eae基因用質(zhì)粒載入后，細(xì)菌的黏附能力隨即得到恢復(fù)，從而進(jìn)一步證實(shí)了

6、Intimin與致病能力的關(guān)系。 長(zhǎng)期以來(lái)，很多研究人員對(duì)EHEC O157：H7 Intimin黏附腸上皮細(xì)胞及在人和動(dòng)物腸道定居過(guò)程中所起的作用進(jìn)行了不斷探索。研究結(jié)果顯示，Intimin是EHEC O157：H7向人類(lèi)腸上皮細(xì)胞黏附及在動(dòng)物腸道中形成A/E損傷所必需的毒力蛋白。McKee等發(fā)現(xiàn)在其N(xiāo)-末端切除1/3的區(qū)域，Intimin仍表現(xiàn)出相同的活性，Intimin真核細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于多肽鏈C-末端的280個(gè)氨基酸內(nèi)

7、（Int280）。Adu-Bobie等對(duì)Int280進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Intimin至少有α、β、γ、δ等四個(gè)亞型，Oswald等在人和牛的EHEC菌株中發(fā)現(xiàn)Intimin的第五個(gè)亞型Intiminε。EHEC O157：H7的Intimin屬于γ型，由934個(gè)氨基酸組成，其活性定位在Int280。目前發(fā)現(xiàn)3種大腸桿菌O157：H7 Intimin受體：細(xì)菌自身編碼的Tir、核仁素和β1整合素。2002年，Sinclair等發(fā)現(xiàn)表達(dá)在Hep

8、-2細(xì)胞表面的核仁素也是EHEC O157：H7 Intiminγ的受體。 本研究試圖對(duì)eae基因進(jìn)行克隆與表達(dá)，純化得到重組蛋白Intimin，利用Western blot檢測(cè)其免疫反應(yīng)性，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)Intimin對(duì)Hep-2細(xì)胞的黏附作用，證明Intimin可以黏附于Hep-2細(xì)胞表面，推測(cè)該作用應(yīng)該是通過(guò)膜表面受體介導(dǎo)的。為后序進(jìn)行膜受體純化、最終闡明Intimin參與的相關(guān)致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 二、研究方

9、法 1.EHEC O157：H7 eae基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建依GenBank上公布的eae基因核苷酸序列（accession number：z11541），運(yùn)用Primer5.0、DNAMAN設(shè)計(jì)引物1、2，上游引物P1為5'GGTGGTCA TATGATTACTCATGGTTGTTAT3’（NdeⅠ）；下游引物P2為5'CCGTC TCGAGTTCTACACAAACCGCATAG3'（XhoⅠ）。以EHEC O157：H7全

10、菌作為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出eae基因，再將eae基因克隆至pMD19-T，構(gòu)建出克隆重組質(zhì)粒pMD19T-eae，利用三酶切（ScaⅠ、NdeⅠ和XhoⅠ）從克隆重組質(zhì)粒上回收eae基因片段，然后與經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ酶切的表達(dá)載體pET-28a（+）連接，構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+）-eae，并轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）。 2.EHEC O157：H7緊密黏附素的表達(dá)與純化對(duì)轉(zhuǎn)化的宿主菌E.coli BL

11、21（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，綜合考慮Intimin的表達(dá)量和表達(dá)外源蛋白對(duì)宿主菌的不利影響，對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行分組優(yōu)化：誘導(dǎo)溫度分為30℃和37℃兩組，IPTG終濃度分為0.0、0.1、0.5、1.0、2.0和3.0mmol/L共6組，誘導(dǎo)時(shí)間分為0、1、2、4和6h共5組，根據(jù)優(yōu)化結(jié)果確定最適蛋白表達(dá)條件。超聲破菌鑒定Intimin在大腸桿菌中表達(dá)方式。8M尿素溶解包涵體，利用重組蛋白Intimin上的His-Tag與Ni2+-NTA

12、瓊脂糖凝膠柱作用進(jìn)行親和層析，改變咪唑濃度純化出Intimin，尿素按8M、4M、0M的遞降梯度在4℃條件下對(duì)其透析復(fù)性48h。 3.EHEC O157：H7緊密黏附素功能的初步研究用兔抗EHEC O157：H7多抗血清作為一抗對(duì)純化后的Intimin進(jìn)行Western blot檢測(cè)；細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)Intimin對(duì)Hep-2細(xì)胞的作用，對(duì)Intimin孵育濃度進(jìn)行分組：5、10、20μg/ml，共3組。用小鼠Anti-Hi

13、s作為一抗、羊抗鼠IgG-Alexa Fluor546作為二抗，觀察黏附在Hep-2細(xì)胞上的紅色熒光情況。 三、結(jié)論 本研究用EHEC O157：H7全菌作為模板，PCR擴(kuò)增出編碼Intimin的全長(zhǎng)eae基因，T-A克隆構(gòu)建了重組克隆質(zhì)粒pMD19T-eae并測(cè)序分析，BLAST比對(duì)，與GenBank上公布的eae基因序列（accession number：z11541）有99%的同源性。據(jù)分析，有9個(gè)堿基發(fā)生突變，對(duì)

14、應(yīng)氨基酸突變位點(diǎn)分別為241、312、313，由于Intimin結(jié)構(gòu)域位于C-末端280個(gè)氨基酸內(nèi)，突變位置遠(yuǎn)離結(jié)構(gòu)域，對(duì)Intimin功能影響不大；另外，EHEC O157：H7菌株之間存在差異，本研究用的是廣州菌株，而比對(duì)時(shí)是與標(biāo)準(zhǔn)菌株序列進(jìn)行比對(duì)，所以序列同源性就可能達(dá)不到100%。三酶切（ScaⅠ、NdeⅠ和XhoⅠ）回收得到eae基因，再通過(guò)連接、轉(zhuǎn)化、篩選出重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+）-eae。 通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)溫度、

15、時(shí)間和IPTG濃度的優(yōu)化，確定在E.coli BL21（DE3）中誘導(dǎo)eae表達(dá)Intimin的合適條件：IPTG終濃度1.0 mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h。超聲破菌鑒定出Intimin是以包涵體形式表達(dá)。包涵體經(jīng)尿素溶解后，用Ni2+-NTA-瓊脂糖凝膠柱對(duì)其進(jìn)行親和層析，純化出Intimin，梯度減低尿素濃度充分復(fù)性得到純化的重組蛋白Intimin。 Western blot檢測(cè)出Intimin對(duì)兔抗EHEC O157：