腸出血型大腸埃希菌O157-H7 espF基因結(jié)構(gòu)域缺失株的構(gòu)建及功能研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　腸出血型大腸埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)是大腸埃希菌的一個(gè)亞型，有100余種血清型，其中O157∶H7是EHEC中引起危害最大的病原菌。EHEC O157∶H7通過糞-口途徑傳播，主要寄居于牛、羊等反芻動(dòng)物體內(nèi)，是一種食源性人畜共患腸道致病菌。同其他EHEC血清型主要引起感染性腹瀉不同，EHEC O157∶H7能夠引起出血性結(jié)腸炎(Hemorrhag

2、ic colitis，HC)、溶血性尿毒綜合癥(Haemolytic uraemic syndrome，HUS)和血栓性血小板減少性紫癜(thrombotic thromobocytopenic purpura,TTP)等疾病。
　　目前，國內(nèi)外對(duì)EPEC的EspF蛋白功能進(jìn)行了較為深入的研究，但對(duì)EHEC的EspF蛋白功能研究較少，其與腸上皮細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用、誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制以及EspF蛋白各個(gè)功能域的作用仍不明確。本

3、課題組在前期工作中構(gòu)建了EHEC O157∶H7espF基因N端缺失株，證明大腸桿菌O157∶H7EspF蛋白N端能靶向結(jié)合線粒體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而EspF蛋白C端PRR區(qū)能與宿主細(xì)胞中SNX9等蛋白通過其SH3結(jié)合域結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)形成了一個(gè)復(fù)雜而龐大的蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路和細(xì)胞凋亡存在某種聯(lián)系。那么這些蛋白是怎樣協(xié)同作用啟動(dòng)或介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡呢？是否與出血性腸炎有關(guān)呢？仍有待于進(jìn)一步研究。根據(jù)EspF蛋白的結(jié)構(gòu)研

4、究，本研究從EspF的N端結(jié)構(gòu)域與C端PRR結(jié)構(gòu)域入手，利用λRed重組系統(tǒng)構(gòu)建了3株EHEC O157∶H7 EDL933w菌株的基因缺失株:espF基因缺失株(EHEC O157∶H7EDL933w△espF)、espF基因N端缺失株(EHEC O157∶H7 EDL933w△espF-N)和espF基因C端缺失株(EHEC O157∶H7 EDL933w△espF-C)。同時(shí)構(gòu)建各自的回補(bǔ)株，研究比較野生株、缺失株與回補(bǔ)株的生物學(xué)

5、差異、對(duì)宿主細(xì)胞的黏附力差異及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力差異，初步研究了各功能域?qū)?xì)菌毒力的影響及相關(guān)功能。
　　研究方法：
　　1、EHEC O157∶H7 espF基因結(jié)構(gòu)域缺失株與回補(bǔ)株的構(gòu)建
　　(1)缺失株的構(gòu)建
　　根據(jù)GenBank的espF基因序列(Accession NO.NC_02655)及其上、下游的DNA序列，設(shè)計(jì)合成兩對(duì)含同源臂引物:H1K1、H2K2和H3K3、H4K4。H1K1與H2K2用于

6、構(gòu)建espF基因敲除株打靶片段，H3K3與H2K2用于構(gòu)建espF基因N端敲除株打靶片段，H1K1與H4K4用于構(gòu)建espF基因C端敲除株打靶片段。這4條引物5'端為與待敲除區(qū)域基因上下游50bp同源的同源臂，用于擴(kuò)增打靶片段兩端的同源臂，3'端與卡那霉素抗性基因部分序列同源，用于擴(kuò)增打靶片段中央的卡那霉素抗性基因。以含卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒pKD4為模板，分別以H1K1與H2K2、H3K3與H2K2、H1K1與H4K4為引物PCR擴(kuò)增

7、，得到espF基因卡那霉素抗性打靶片段、espF-N基因卡那霉素抗性打靶片段、espF-C基因卡那霉素抗性打靶片段。將打靶片段電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入含有pKD46質(zhì)粒的EHEC O157∶H7 EDL933w菌株中，利用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)pKD46質(zhì)粒表達(dá)重組酶，利用λRed同源重組系統(tǒng)，卡那霉素抗性片段的卡那霉素抗性基因替換待敲除的espF、espF-N、espF-C基因。利用卡那霉素篩選出陽性重組菌，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物F1、R2和F2、R1，其中F1

8、、R2位于espF基因上下游，F(xiàn)2、R1位于卡那霉素抗性基因上，通過交叉引物PCR及測序，驗(yàn)證陽性菌是否發(fā)生了同源重組。
　　(2)回補(bǔ)株的構(gòu)建
　　根據(jù)GenBank的espF基因序列(Accession NO.NC_02655)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物:Fc、Rn和Fn、Rc。引物Fc與Rn擴(kuò)增espF基因片段，引物Fn與Rn擴(kuò)增espF-N基因片段，引物Fc與Re擴(kuò)增espF-C端基因片段。將PCR擴(kuò)增片段切膠純化，與載體pGEM

9、-T easy進(jìn)行連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5α，利用氨芐霉素篩選陽性菌，PCR并測序，得到完成連接的DH5α pGEM-espF、DH5α pGEM-espF-N、DH5α pGEM-espF-C菌株。培養(yǎng)提取質(zhì)粒后分別電擊轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入相應(yīng)基因缺失株△espF、△espF-N、△espF-C。氨芐霉素篩選陽性菌，提取質(zhì)粒，以Fc、Fn、Rc、Rn為引物PCR并測序驗(yàn)證回補(bǔ)質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入缺失株，成功構(gòu)建回補(bǔ)株。
　　2、野生株與突變株

10、生物學(xué)特征的比較
　　野生株和突變株經(jīng)涂片-干燥-固定后進(jìn)行革蘭染色:初染-媒染-脫色-復(fù)染，光學(xué)顯微鏡觀察。在相同培養(yǎng)條件下，在0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20 h分別測定野生株和突變株的OD600值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制各菌株的生長曲線。
　　3、細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)
　　(1)吉姆薩(Giemsa)染色觀察細(xì)菌黏附
　　結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo于6孔板培養(yǎng)至單層后，分別

11、用相同濃度EHEC O157∶H7野生株和突變株感染細(xì)胞2小時(shí)，按吉姆薩染色步驟處理:涂片-固定-染色-洗脫。在光學(xué)顯微鏡下觀察野生株和突變株對(duì)Lovo細(xì)胞的黏附情況。(2)涂板計(jì)算細(xì)菌黏附率
　　過夜培養(yǎng)的野生株、espF缺失株（△espF）、N端缺失株(△espF-N)、C端缺失株（△espF-C）、和陰性對(duì)照菌(DH5α)共5株，重懸于不含抗生素的培養(yǎng)基(DMEM，10％胎牛血清)，重懸后細(xì)菌的濃度均為2×107/mL。Lo

12、vo細(xì)胞培養(yǎng)于12孔板內(nèi)，長至單層細(xì)胞（約2×105cells/孔）。以每孔2×107的細(xì)菌量接種到培養(yǎng)Lovo細(xì)胞的12孔板內(nèi)(細(xì)胞感染倍數(shù)100∶1)，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板混勻。細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱，37℃，5％ CO2，培養(yǎng)1.5-2h。每種細(xì)菌接種4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)后細(xì)胞用PBS洗3次，加入150μl的0.5％Triton X-100裂解細(xì)胞，孵育8min后，加入100μl PBS，反復(fù)吹打吸出樣品，每孔樣品分別10-2、10-3、10-

13、4梯度稀釋后涂布于同一塊瓊脂平板上均勻分布的三區(qū)中，每區(qū)加稀釋后的菌液20uL，輕柔地對(duì)平板進(jìn)行傾斜旋轉(zhuǎn)，使得各區(qū)菌液面積均勻擴(kuò)大但不得超過分區(qū)的劃線。24小時(shí)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算黏附率（黏附率=黏附到細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)/初始加到細(xì)胞孔的總細(xì)菌數(shù)×1000‰）。用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One Way ANOVA)，比較各菌株黏附率平均值的差異。
　　結(jié)果：
　　1、構(gòu)建了三株EHEC O157∶H7 EDL933

14、w espF基因缺失株:espF基因缺失株(△espF)、N端缺失株(△espF-N)、C端缺失株（△esp F-C），并構(gòu)建了各自的基因回補(bǔ)株
　　用引物H1-K1與H2-K2、H3K3與H2K2、H1K1與H4K4，分別PCR擴(kuò)增出卡那霉素抗性打靶片段，大小為1576bp，分別電擊轉(zhuǎn)化于含有質(zhì)粒pKD46的EHEC O157∶H7 EDL933w感受態(tài)細(xì)胞中。用含kana的LB固體培養(yǎng)基篩選得到陽性菌，增菌后，用卡那霉素基因內(nèi)

15、部鑒定引物PCR電泳驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)野生株中無目的條帶，缺失株中可見到一條大小為471bp的片段。測序證實(shí)，菌株EHEC O157∶H7 espF基因(747bp)、espF-N基因(219)和espF-C基因(528)完全缺失。
　　用引物Fc與Rn、Fn與Rn、Fc與Rc，分別PCR擴(kuò)增出回補(bǔ)片段，大小分別為747bp、219bp、528bp，經(jīng)瓊脂糖電泳，切膠純化回收后，與載體pGEM-T easy于4℃連接12h后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)

16、胞DH5α中，用氨芐霉素LB固體培養(yǎng)基篩選陽性菌，將篩選到的陽性菌提取質(zhì)粒后用通用引物M13 PCR并測序。根據(jù)測序結(jié)果確定含有正確重組載體的陽性菌，將其擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，分別電擊轉(zhuǎn)化入相應(yīng)的基因缺失株△espF、△espF-N、△espF-C，成功構(gòu)建了基因回補(bǔ)株。
　　2、野生株與缺失株生物學(xué)特征比較結(jié)果
　　經(jīng)革蘭染色可見，野生株和三株突變株均為革蘭染色陰性，短小棒狀桿菌。根據(jù)所測的OD600繪制生長曲線，野生株和突

17、變株的生長曲線趨勢基本一致。
　　3、細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)
　　吉姆薩染色可見野生株黏附于細(xì)胞的數(shù)量較多，突變株較少，黏附數(shù):野生株多于突變株多于DH5α。涂板后計(jì)數(shù)菌落，計(jì)算細(xì)菌的黏附率，數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析，結(jié)果顯示，野生株與突變株間的黏附率比較P＜0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。野生株的平均黏附率是13.879±3.578‰，突變株△espF的平均黏附率是6.401±1.519‰，突變株△espF-N的平均黏附率是5.402±3.2

18、12‰，突變株△espF-C的平均黏附率是4.795±1.950‰，DH5α平均黏附率是0。
　　結(jié)論：
　　1.利用λRed同源重組系統(tǒng)，成功構(gòu)建了EHEC O157∶H7 EDL933w espF缺失株（△espF）、N端缺失株(△espF-N)和C端缺失株（△espF-C），并成功構(gòu)建了espF基因回補(bǔ)株、N端回補(bǔ)株和C端回補(bǔ)株。為今后EHECO157∶H7 EspF蛋白的功能研究打下了基礎(chǔ)。
　　2.espF基