集成化微流控芯片的研制及其在大腸埃希菌O157-H7檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、研究目的：
　　在病原菌快速檢測(cè)微流控芯片中引入微閥微通道大規(guī)模集成技術(shù),研制一種集成多通道和多組氣閥的集成化微流控芯片,利用集成化微流控芯片操作的并行性?xún)?yōu)勢(shì)實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化、低成本、快速檢測(cè)大腸埃希菌O157:H7。
　　研究方法：
　　1、研制集成化微流控芯片自動(dòng)化反應(yīng)系統(tǒng):采用autoCAD2007軟件設(shè)計(jì)集成化微流控芯片CAD圖片;采用模塑法和多層軟光刻技術(shù)制作集成化PDMS微流控芯片;組裝單片機(jī)、電磁閥等電

2、子器件,研制本芯片專(zhuān)用的微閥控制器;將制備好的微流控芯片以及氣閥控制器與注射器、注射泵、熒光倒置顯微鏡和CCD等設(shè)備連接起來(lái),搭建自動(dòng)化的集成化微流控芯片反應(yīng)系統(tǒng)。
　　2、研究集成化微流控芯片的最佳表面修飾及抗體固定方法:以玻片為載體,對(duì)物理吸附、直接共價(jià)結(jié)合及共價(jià)結(jié)合與親和結(jié)合聯(lián)用三種抗體固定方法進(jìn)行系統(tǒng)性對(duì)比研究:通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化各反應(yīng)的最佳反應(yīng)參數(shù);在最佳反應(yīng)條件下,比較物理吸附及直接共價(jià)結(jié)合方法固定蛋白質(zhì)的效率,從中篩

3、選出固定蛋白分子效率最高的表面修飾方法;以篩選出的最佳表面修飾方法為基礎(chǔ),將蛋白 G和鏈霉親和素分別固定在芯片內(nèi),比較此兩種親和定向固定方法保持抗體活性的能力,從中篩選出保持抗原結(jié)合能力最高的抗體固定方法,最終確定最佳的抗體固定方法。
　　3、建立基于集成化微流控芯片的大腸埃希菌O157:H7檢測(cè)體系并初步應(yīng)用:以集成化微流控芯片自動(dòng)化反應(yīng)系統(tǒng)為平臺(tái),以最佳抗體固定方法固定抗體,在芯片通道交叉處構(gòu)建出10個(gè)檢測(cè)單元。在此基礎(chǔ)上,以

4、免疫熒光技術(shù)為檢測(cè)手段,建立基于集成化微流控芯片的大腸埃希菌O157:H7快速檢測(cè)方法并將此方法初步應(yīng)用于礦泉水、牛奶及糞便模擬污染樣品的檢測(cè)。
　　研究結(jié)果：
　　1、成功研制了集成有40個(gè)氣動(dòng)微閥及11條微通道的集成化微流控芯片,以及配套的微閥控制器。并以此芯片為反應(yīng)單元;以氣動(dòng)微閥控制器為控制中心;以十通道注射泵為動(dòng)力源;以常規(guī)熒光倒置顯微鏡和CCD為檢測(cè)器,成功搭建了一套集成化微流控芯片自動(dòng)化反應(yīng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過(guò)微閥

5、控制器即可簡(jiǎn)單、快速、便捷地同時(shí)控制微流控芯片內(nèi)11條通道的開(kāi)關(guān)。
　　2、在反應(yīng)條件為:5％硫醇在60℃下反應(yīng)1h,2mg/mL馬來(lái)酰胺室溫下反應(yīng)30min時(shí),玻片上的固定蛋白熒光信號(hào)最強(qiáng);在反應(yīng)條件為:1mg/mL鏈霉親和素(SA)在室溫下反應(yīng)1h,10ug/mL生物素修飾的捕獲抗體室溫下固定30min時(shí),玻片上的固定抗體熒光信號(hào)最強(qiáng),細(xì)菌捕獲率最高。
　　3、在反應(yīng)條件為:進(jìn)樣速度及時(shí)間分別為1μL/min和30min

6、,檢測(cè)抗體濃度及反應(yīng)時(shí)間分別為50ug/mL和30min時(shí),基于集成化微流控芯片系統(tǒng)檢測(cè)大腸埃希菌O157:H7的檢測(cè)通量為10樣本/次,總檢測(cè)時(shí)間和試劑耗量為1h和5μL,對(duì)大腸埃希菌O157:H7的最低檢測(cè)限為1.6×103 CFU/mL,與大腸埃希菌ATCC25922及傷寒沙門(mén)菌ATCC14028無(wú)交叉反應(yīng),批內(nèi)精密度為5.2%。將本法初步應(yīng)用于礦泉水、牛奶及糞便懸液模擬污染樣品中大腸埃希菌 O157:H7的測(cè)定,檢測(cè)敏感度分別為

7、92%、78%和62%,檢測(cè)特異度均為100%,與培養(yǎng)金標(biāo)法的總體符合率均>80%,Kappa值顯示本方法與金標(biāo)法一致性較好。
　　結(jié)論：
　　1、通過(guò)多層軟光刻工藝可制作高度集成的微流控芯片;通過(guò)組裝單片機(jī)和電磁閥可制作專(zhuān)用的芯片控制器;基于集成化微流控芯片自動(dòng)化反應(yīng)系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)并行高通量運(yùn)行及流體操作的自動(dòng)化,具有很好的可行性和靈活的操作性。
　　2、巰基-馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)硅烷化法固定蛋白質(zhì)的效率比物理吸附法、氨基硅烷