應(yīng)用噬菌體控制牛及其飼養(yǎng)環(huán)境中大腸桿菌O157-H7的研究.pdf

1、食源性致病菌—大腸桿菌O157:H7(EscherichiacoliO157:H7)已成為危害人類健康的嚴(yán)重世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題。牛及其飼養(yǎng)環(huán)境是大腸桿菌O157:H7的主要寄居場(chǎng)所及重要的傳播源，在飼養(yǎng)場(chǎng)建立切實(shí)可行的控制策略可以有效地從源頭上降低甚至完全消除致病菌的流行，減少和切斷致病菌通過(guò)食物鏈和環(huán)境污染等途徑傳播，從而保障人類健康。目前，控制動(dòng)物個(gè)體及其飼養(yǎng)環(huán)境中的病原菌尚無(wú)有效方法。本論文主要通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外裂解實(shí)驗(yàn)考察噬菌體

2、的體內(nèi)控制效果、裂解能力和宿主范圍，并通過(guò)探索牛及其飼養(yǎng)環(huán)境中天然噬菌體的分布特性、變化規(guī)律及在同一生態(tài)系統(tǒng)中噬菌體與大腸桿菌O157:H7之間的相互作用關(guān)系，探討和評(píng)價(jià)在飼養(yǎng)場(chǎng)實(shí)施噬菌體控制策略的有效性和可行性，為保障食品源頭安全和環(huán)境安全創(chuàng)建一個(gè)高效、綠色、安全、無(wú)公害的生物防治平臺(tái)。 以攻毒感染公牛為模型，選用直腸糞樣法和直腸肛門連接處粘液拭子法監(jiān)測(cè)大腸桿菌O157:H7的排泄量/檢出率，考察四株噬菌體(rV5、wV7、w

3、V8和wV11)口服給藥的控制效果。綜合對(duì)照組和給藥組的檢測(cè)結(jié)果，糞樣的總陽(yáng)性率(78.9％，202/256)顯著高于拭子樣本(62.9％，161/256；P＜0.01)，二者之間的檢測(cè)一致性為一般到中等(fairtomoderate，κ=0.36～0.45)；給藥組口服噬菌體后，大腸桿菌O157:H7的總排泄量顯著降低(P＜0.05)。糞樣法比拭子法更能準(zhǔn)確和有效地監(jiān)測(cè)噬菌體的控制效果，口服四株噬菌體的混合制劑降低了牛大腸桿菌O157

4、:H7的總排泄量。 以加拿大阿爾伯塔(Alberta)地區(qū)商業(yè)化肉牛和奶牛飼養(yǎng)場(chǎng)及臨床病例分離獲得的422株大腸桿菌O157:H7菌株為研究對(duì)象，采用噬菌體分型技術(shù)和脈沖場(chǎng)電泳技術(shù)(pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE)鑒定牛源分離株的噬型特征和基因型，通過(guò)建立微孔板分析法計(jì)算噬菌體裂解分離株的感染復(fù)數(shù)，評(píng)價(jià)噬菌體的宿主譜和裂解能力。噬菌體wV7、wV8、rV5和wV11的寬噬率分別為100％、

5、96.4％、81.0％和76.1％；wV7裂解分離株的感染復(fù)數(shù)最低(0.004～0.006，P＜0.0001)，其次為rV5和wV11(0.002～0.04，P＜0.0001)，wV8最高(25～29，P＜0.0001)；牛源分離株對(duì)rV5、wV11和wV8的易感性與其噬型和/或PFGE基因型有關(guān)。研究表明噬菌體的宿主譜和裂解能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)感染復(fù)數(shù)應(yīng)同時(shí)作為篩選治療性噬菌體的標(biāo)準(zhǔn)；口服給藥的四株噬菌體可以有效裂解大部分受檢菌株，不同飼養(yǎng)

6、場(chǎng)的菌株對(duì)噬菌體wV8表現(xiàn)出不同的易感性，發(fā)現(xiàn)噬菌體rV5、wV11和wV8的易感性受其噬菌體表型和/或PFGE基因型影響，而噬菌體wV7的宿主譜和裂解能力不受菌株的噬菌體表型和PFGE基因型的影響，能夠高效裂解所有受檢分離株。 自2007年5～11月，采用初篩法和富集法從加拿大阿爾伯塔省南部?jī)杉疑虡I(yè)化肉牛飼養(yǎng)場(chǎng)采集的個(gè)體直腸糞樣、新鮮地面糞樣、水槽中的飲用水和沉淀物樣本(簡(jiǎn)稱飲水樣)以及地面糞尿泥漿樣本中檢測(cè)和分離天然大腸桿菌

7、O157:H7噬菌體。噬菌體的總檢出率為28.0％(239/855)，其中糞尿泥漿樣本檢出率顯著高于其它樣本，達(dá)94.6％(35/37，P＜0.001)：地面糞樣中噬菌體的檢出率呈周期性振蕩變化，其中5月份最高(P＜0.05)；另外，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示若噬菌體在環(huán)境中的檢出率較高時(shí)，大腸桿菌O157:H7在牛群中的檢出率則較低(P＜0.01)，Pearson相關(guān)性分析表明，同一個(gè)體糞樣中噬菌體和大腸桿菌O157:H7的存在呈負(fù)向相關(guān)(r=-

8、0.11，P＜0.05)。噬菌體廣泛存在于牛場(chǎng)的動(dòng)物個(gè)體及其周圍環(huán)境中，糞尿泥漿中噬菌體的檢出率高于地面糞樣和飲水樣，地面糞樣中噬菌體檢出率與大腸桿菌O157:H7呈現(xiàn)類似的周期性振蕩變化規(guī)律；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示存在于動(dòng)物個(gè)體及其環(huán)境中的噬菌體均能顯著降低大腸桿菌O157:H7在牛群中的檢出率。 綜上，本論文證明了噬菌體控制大腸桿菌O157:H7的有效性和可行性，初步揭示了飼養(yǎng)牛的生態(tài)系統(tǒng)中天然噬菌體檢出率的變化規(guī)律為周期性振蕩，統(tǒng)