免疫磁珠分離結(jié)合熒光微球免疫層析方法的建立及在大腸桿菌O157-H7檢測中的應(yīng)用.pdf

1、大腸桿菌O157∶H7是腸出血性大腸桿菌（EHEC）中最具代表性的血清型，能引起腹瀉、出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒綜合癥或血栓形成性血小板減少性紫癜等疾病，該菌已在世界范圍內(nèi)引起感染流行。因此，探索建立能適用于現(xiàn)場或基層的靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測方法，對于該菌的防控具有重要意義。免疫層析方法以其檢測快速、操作簡便、靈敏度高等特點(diǎn)成為該菌篩查中的常用方法。
　　 標(biāo)記物的選取在免疫層析技術(shù)中至關(guān)重要，目前，膠體金的應(yīng)用最為廣泛。本研究

2、在大量的前期工作基礎(chǔ)上，比較了納米熒光微球和膠體金作為標(biāo)記物偶聯(lián)抗大腸桿菌O157∶H7單克隆抗體的偶聯(lián)率，制備了基于雙抗體夾心原理的熒光微球微球試紙條(FM-ICTS)和膠體金試紙條(CG-ICTS)，首次對抗體與標(biāo)記物的偶聯(lián)規(guī)律對免疫層析方法的影響進(jìn)行了深入細(xì)致的比對研究。單抗與熒光微球的偶聯(lián)率隨著抗體投入量的增加而降低，但是偶聯(lián)到微球表面的抗體量卻不斷增加，當(dāng)抗體與熒光微球的比例達(dá)到100μg/mg時(shí)，層析方法的靈敏度不會再隨抗體

3、標(biāo)記量增加而提高;單抗與膠體金的偶聯(lián)率并未隨抗體投入量的增加呈現(xiàn)規(guī)律性變化，當(dāng)抗體與膠體金的比例達(dá)到10μg/mL時(shí)，增加抗體的投入量也不會提高試紙條靈敏度。最終結(jié)果顯示，F(xiàn)M-ICTS的靈敏度為9.6×103 CFU/mL，要比CG-ICTS的靈敏度高約5倍，每張F(tuán)M-ICTS消耗的單抗量為0.1μg，而每張CG-ICTS消耗的單抗量為0.4μg，所以在該檢測體系中，從檢測靈敏度和抗體使用量角度比較，熒光微球更具優(yōu)勢。當(dāng)菌液濃度高于1

4、06 CFU/mL后，檢測線(T線)出現(xiàn)信號降低的趨勢，出現(xiàn)免疫層析中較少報(bào)道的HOOK效應(yīng)，印證了層析反應(yīng)也遵從ELISA免疫反應(yīng)規(guī)律，此效應(yīng)在FM-ICTS和CG-ICTS現(xiàn)象一致。
　　 免疫磁性分離技術(shù)(IMS)已廣泛應(yīng)用于致病菌的分離中，本研究IMS與FM-ICTS相結(jié)合，成功的應(yīng)用于生牛乳中大腸桿菌O157∶H7的檢測。1mL純培養(yǎng)大腸桿菌O157∶H7肉湯體系，用IMS富集濃縮10倍后用于FM-ICTS檢測，能明顯