EHEC O157-H7和空腸彎曲菌氨基磁珠-LAMP檢測方法的建立.pdf

1、腸出血性大腸桿菌O157∶H7是一種重要的人獸共患性和食源性致病菌，主要通過污染肉制品、奶制品、水等食物進(jìn)入人體，也可以通過人與人、人與動(dòng)物的密切接觸進(jìn)行傳播。其感染力和致病性很強(qiáng)，引發(fā)的感染具有暴發(fā)流行性，對(duì)人類健康構(gòu)成極大威脅，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題?？漳c彎曲菌是禽類和多種動(dòng)物腸道內(nèi)的正常寄居菌，也是一種重要的食源性致病菌，被認(rèn)為是引起全世界人類細(xì)菌性腹瀉的主要原因之一，消費(fèi)者食用被污染的食品（尤其是禽肉）或水后可以引發(fā)多種疾病

2、，給公共衛(wèi)生帶來了極大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　應(yīng)用特異、靈敏、快速的方法檢測食品中這兩種致病菌是預(yù)防和控制其暴發(fā)流行的重要環(huán)節(jié)?，F(xiàn)有檢測技術(shù)的缺點(diǎn)是:分離培養(yǎng)方法需要增菌，檢測時(shí)間長;免疫學(xué)檢測方法需要高質(zhì)量的抗體，靈敏度和特異性普遍不高;PCR需要昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器，單純應(yīng)用分子生物學(xué)檢測技術(shù)也需要對(duì)樣品進(jìn)行前增菌。
　　1.HNB-LAMP檢測方法的建立及評(píng)價(jià)
　　本研究選取EHEC O157∶H7和空腸彎曲菌種屬特異

3、性靶基因ORF-Z3276、VS1基因分別設(shè)計(jì)LAMP反應(yīng)引物，優(yōu)化反應(yīng)體系并建立檢測這兩種菌的HNB-LAMP方法，試驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的HNB-LAMP方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，僅對(duì)EHECO157∶H7和空腸彎曲菌呈陽性反應(yīng)，而對(duì)其他大腸桿菌、沙門菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌等食源性致病菌均為陰性。
　　2.氨基磁珠制備及吸附DNA條件的優(yōu)化
　　通過共沉淀、反相微乳液及氨基化硅烷偶聯(lián)劑修飾等步驟制備能穩(wěn)定吸附DNA的氨基磁

4、珠，優(yōu)化氨基磁珠吸附DNA的條件，確定了氨基磁珠的最佳吸附pH為7.0，最佳吸附溫度為常溫，最佳吸附時(shí)間為30rain，氨基磁珠的添加量隨樣品性質(zhì)決定。
　　3.氨基磁珠提取人工污染牛奶肉類致病菌DNA的方法
　　探索出氨基磁珠提取致病菌污染的牛奶和肉類DNA的方法。其中氨基磁珠與人工污染牛奶樣品DNA復(fù)合物直接加入PCR/LAMP體系進(jìn)行檢測;結(jié)合在氨基磁珠表面的人工污染肉類樣品需要洗脫DNA，以洗脫液為PCR/LAMP模

5、板進(jìn)行檢測。
　　4.氨基磁珠-LAMP檢測方法的建立
　　將氨基磁珠提取DNA與LAMP技術(shù)結(jié)合，建立EHEC O157∶H7和空腸彎曲菌氨基磁珠-LAMP檢測方法。該方法檢測動(dòng)物源性食品樣品無需增菌，從樣品處理到LAMP結(jié)果判定整個(gè)檢測流程僅需4.5h。氨基磁珠-LAMP方法檢測EHEC O157∶H7人工污染牛奶、豬肉樣品的靈敏度為60 CFU，而氨基磁珠-PCR方法的靈敏度為600CFU;氨基磁珠-LAMP方法檢測空