空腸彎曲菌多價(jià)DNA疫苗的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目前，空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni，C．jejuni)感染已成為全球范圍內(nèi)急性胃腸炎最常見的病因之一。更具嚴(yán)重后果的是該菌與格林一巴利綜合征(Guillain-Barr~syndrome，GBS)有非常密切的關(guān)系，是導(dǎo)致GBS發(fā)生的重要前驅(qū)感染原。但是，由于目前對(duì)C．jejuni的遺傳學(xué)特性、毒力因子、致病作用和C．jejuni誘發(fā)GBS的機(jī)制尚不完全明了，至今仍缺少有效而可行措施來預(yù)防C．jejuni腹瀉和GBS

2、的發(fā)生。為此，本研究針對(duì)C．jejuni是一種多變、易變的腸道感染細(xì)菌，利用DNA疫苗誘導(dǎo)特異性體液免疫、細(xì)胞免疫的優(yōu)勢(shì)和殼聚糖增強(qiáng)粘膜吸收、緩釋等特性，設(shè)計(jì)制備了具有高效粘膜免疫應(yīng)答的C．jejuni多價(jià)DNA疫苗。并探討其在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的效應(yīng)和在小鼠C．jejuni攻擊模型中的免疫保護(hù)力，以及其在應(yīng)用中的周圍神經(jīng)安全性問題。為深入開發(fā)新型C．jejuni疫苗奠定理論基礎(chǔ)。課題分四部分： 第一部分 空腸彎曲菌多價(jià)

3、DNA疫苗的構(gòu)建及其表達(dá) 目的：利用基因工程技術(shù)分別構(gòu)建C．jejunicadF和peblA基因的真核表達(dá)重組質(zhì)粒，并以此重組質(zhì)粒DNA為核心，通過殼聚糖包裹DNA，構(gòu)建C．jejuni多價(jià)DNA疫苗。并評(píng)價(jià)殼聚糖作為DNA疫苗遞呈系統(tǒng)，其促進(jìn)DNA疫苗在真核細(xì)胞中表達(dá)的有效性和安全性。 方法：(1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定：分別以C．jejuniHS：2、‘HS：8、HS：19和HS：21的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)

4、增，獲得四種血清型的cadF和peblA基因DNA片段，并測(cè)序比較HS：2和HS：19peblA基因的同源性。在此基礎(chǔ)上，選擇與GBS最為相關(guān)的C．jejuniHS：19cadF和peblA基因PCR純化產(chǎn)物為目的基因DNA片段，分別定向插入真核表達(dá)載體pcDNA3．1(+)，以構(gòu)建pcDNA3．1(+)一cadF和pcDNA3．1(+)一peblA重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定、PCR鑒定和DNA雙向測(cè)序確認(rèn)。(2)重組質(zhì)粒在COS-

5、7細(xì)胞中表達(dá)：以重組質(zhì)粒DNA為核心，分別采用殼聚糖和PolyFect轉(zhuǎn)染試劑包裹DNA，制備殼聚糖-DNA和PolyFect-DNA，轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，RT-PCR方法檢測(cè)其瞬時(shí)表達(dá)，ELISA檢測(cè)其在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物。(3)MTT法檢測(cè)殼聚糖-DNA的細(xì)胞毒性。 結(jié)果：(1)PCR反應(yīng)顯示四種血清型C．jejuni的cadF和peblA基因DNA片段大小一致，DNA雙向測(cè)序證實(shí)C．jejuniHS：19peblA

6、基因序列與HS：2peblA基因序列具有高度同源性。所構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別經(jīng)雙酶切和PCR鑒定，以及DNA雙向測(cè)序證實(shí)目的基因插入成功。(2)采用RT-PCR方法能夠從重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞中擴(kuò)增出與目的基因大小一致的DNA片段。ELISA分析表明在COS一7細(xì)胞培養(yǎng)上清中可獲得目的基因表達(dá)產(chǎn)物。并且，殼聚糖一DNA組與PolyFect-DNA組相比較，其轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)水平更高，轉(zhuǎn)染后3d，其表達(dá)水平增高了5．1倍，PolyFect

7、-DNA組僅增高了2．9倍(P<0．01)。(3)MTT法檢測(cè)顯示，殼聚糖-DNA組與PolyFect-DNA組相比較，其轉(zhuǎn)染細(xì)胞存活率更高，轉(zhuǎn)染后3d，殼聚糖-DNA組90％左右的細(xì)胞生長(zhǎng)良好、形態(tài)正常，而PolyFect-DNA組細(xì)胞的存活率降至65％左右(P<0．01)。 結(jié)論：(1)C．jejunicadF和peblA基因具有高度的保守性，以此成功構(gòu)建的pcDNA3．1(+)一cadF和pcDNA3．1(+)一peblA

8、重組質(zhì)粒均能在COS-7細(xì)胞中有效表達(dá)。(2)殼聚糖-DNA遞呈系統(tǒng)是安全、高效的DNA疫苗遞呈系統(tǒng)。 第二部分 目的：評(píng)價(jià)Cjejuni多價(jià)DNA疫苗經(jīng)粘膜免疫后，誘導(dǎo)特異性體液免疫、細(xì)胞免疫和粘膜免疫應(yīng)答的效應(yīng)。 方法：(1)378只6周BALB／c小鼠被分為9個(gè)大組，每組42只小鼠。于實(shí)驗(yàn)開始的0、7、14和2l天，以未干預(yù)組、pcDNA3．1(+)組和殼聚糖組為對(duì)照，分別將不同效價(jià)的C．jejuniDNA

9、疫苗滴鼻免疫小鼠，包括：pcDNA3。1(+)一cadF和pcDNA3．1(+)一peblA(單抗原裸DNA疫苗)、pcDNA3．1(+)一cadF+pcDNA3．1(+)一peblA(雙抗原裸DNA疫苗)、殼聚糖-pcDNA3．1(+)一cadF和殼聚糖-pcDNA3．1(+)一peblA(殼聚糖一單抗原DNA疫苗)，以及殼聚糖-pcDNA3．1(+)一cadF+pcDNA3．1(+)一peblA(殼聚糖一雙抗原DNA疫苗)。(2)流

10、式細(xì)胞計(jì)量?jī)x檢測(cè)末次免疫后4周小鼠外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞分類情況。(3)ELISA檢測(cè)末次免疫后2、4、6和8周小鼠血清中細(xì)胞因子IFN-7、IL-4和特異性抗體IgA、IgG、IgM水平，以及小鼠糞便中IgA抗體水平。(4)末次免疫后8周各組隨機(jī)抽取6只小鼠，取其小腸組織行免疫組織化學(xué)檢查，以觀察小鼠腸壁SIgA的變化。 結(jié)果：(1)各實(shí)驗(yàn)組與各對(duì)照組相比較：①末次免疫后4周，各實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血CD4+、CDs+T細(xì)胞

11、數(shù)有顯著性升高(P<0．01)；②末次免疫后2、4、6和8周，小鼠血清中IFN-~、IL-4和IgA、IgG、Igm水平，以及糞便中IgA水平，與對(duì)照組相比較均存在顯著性差異(P<0．01)，各對(duì)照組小鼠血清中上述各項(xiàng)參數(shù)一直無變化。各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清IFN-7、IL-4、IgA、IgG、IgM和糞便IgA水平均從免疫后2周開始上升，4周達(dá)頂峰，到第6周和8周時(shí)殼聚糖-DNA疫苗組維持在較高的水平(IgM抗體除外)，而裸DNA疫苗組則迅速

12、下降；③末次免疫后8周，腸壁SIgA免疫組化染色顯示，各實(shí)驗(yàn)組小鼠其小腸粘膜固有層可見不同程度的棕色顆粒沉著，呈(+)～(+++)反應(yīng)，而各對(duì)照組僅表現(xiàn)為(-)～(土)反應(yīng)。(2)對(duì)應(yīng)時(shí)期各實(shí)驗(yàn)組相比較，上述各項(xiàng)指標(biāo)均以殼聚糖．雙抗原DNA疫苗組為最高，殼聚糖一單抗原DNA疫苗組次之，單抗原裸DNA疫苗組最低(P<0．01)。但是，殼聚糖一單抗原DNA疫苗組間比較和單抗原裸DNA疫苗組間比較均無顯著性差異(P>0．05)。 結(jié)論

13、：C．jejuni多價(jià)DNA疫苗經(jīng)鼻免疫小鼠后，能在小鼠體內(nèi)激發(fā)顯著而持久的特異性體液免疫、細(xì)胞免疫和粘膜免疫應(yīng)答。 第三部分 空腸彎曲茵多價(jià)DNA疫苗的免疫保護(hù)性研究 目的：探討C．jejuni多價(jià)DNA疫苗在小鼠C．jejuni攻擊模型中的免疫保護(hù)力，測(cè)試該疫苗的實(shí)際有效性。 方法：(1)末次免疫后第8周，分別采用HS：l9或HS：2單次和HS：19重復(fù)攻擊的方式進(jìn)行C．jejuni不同嚴(yán)重度的灌胃攻擊。(

14、2)實(shí)施C．jejuni攻擊后，對(duì)各種C．jejuniDNA疫苗的免疫保護(hù)作用進(jìn)行比較性評(píng)價(jià)，包括觀測(cè)疾病指數(shù)以判斷疫苗的臨床保護(hù)效率；大便培養(yǎng)以判斷疫苗對(duì)C．jejuni腸道定植的清除效應(yīng)；肝組織勻漿培養(yǎng)以評(píng)價(jià)疫苗阻止C．jejuni感染向腸道外擴(kuò)散的效力。(3)C．jejuniHS：19末次重復(fù)攻擊后第4周，各組隨機(jī)抽取6只小鼠取其小腸組織，行免疫組織化學(xué)檢查，以觀察腸壁SIgA的同步改變。(4)C．jejuni末次攻擊后第4周和1

15、2周，取其坐骨神經(jīng)分別用于原纖維分離檢查、半薄切片光鏡檢查和超薄切片電鏡檢查以觀察疫苗阻止C．jejuni感染誘發(fā)周圍神經(jīng)免疫損傷的效力。并取其小腸和肝臟組織進(jìn)行H&E染色組織病理學(xué)檢查。 結(jié)果：(1)C0ejuni攻擊后引起對(duì)照組小鼠明顯組織病理學(xué)異常，包括：①小腸組織不同程度的充血水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；②肝臟組織顯示細(xì)胞質(zhì)疏松、氣球樣變性、點(diǎn)狀壞死和灶性壞死，并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；③坐骨神經(jīng)組織發(fā)生以軸索變性為主的免疫性損傷。(

16、2)各實(shí)驗(yàn)組和各對(duì)照組在C．jejuniHS：19重復(fù)攻擊時(shí)，其疾病指數(shù)、C．jejuni腸道定植率、C．jejuni腸道外(肝臟)感染擴(kuò)散率和受檢器官病變發(fā)生率均顯著高于HS：19或HS：2單次攻擊(P<0．01)；HS：19單次攻擊時(shí)，其坐骨神經(jīng)病變發(fā)生率又明顯高于HS：2單次攻擊(P<0．01)。(3)與對(duì)照組相比，各C．jejuniDNA疫苗均能不同程度地保護(hù)免疫后小鼠免遭C．jejuniHS：19重復(fù)攻擊和HS：2的感染攻擊，

17、明顯減少C．jeiuni的腸道定植率，有效防止C．jejuni的血行擴(kuò)散，顯著降低受攻擊小鼠的疾病指數(shù)和受檢器官病變發(fā)生率(P<0．01)。其中，殼聚糖一雙抗原DNA疫苗組的免疫保護(hù)作用最強(qiáng)，殼聚糖一單抗原DNA疫苗組次之，單抗原裸DNA疫苗組最低。(4)C．jejuniHS：19重復(fù)攻擊后第4周，免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示小鼠腸壁SIgA呈同步性改變。 結(jié)論：(1)C．jejuni重復(fù)攻擊比單次攻擊具有更強(qiáng)的感染致病力，可作為C．j

18、ejuni對(duì)被免疫動(dòng)物強(qiáng)化攻擊的有效模型。C．jejuniHS：19比HS：2具有更高的致周圍神經(jīng)免疫性損傷的危險(xiǎn)性。(2)C．iejuni多價(jià)DNA疫苗滴鼻免疫小鼠后，能在小鼠體內(nèi)激發(fā)顯著而有效的特異性免疫應(yīng)答，有效地保護(hù)免疫后小鼠抵御C．jejuni重復(fù)感染攻擊，明顯減少該菌在宿主腸道定植和腸道外擴(kuò)散，顯著降低被攻擊小鼠疾病指數(shù)，并伴有腸壁SIgA同步性分泌增多。(3)C．jejuni多價(jià)DNA疫苗在有效抵御C．jejuni腸道感染