空腸彎曲菌致豚鼠不同時(shí)間段周圍神經(jīng)病理損傷的研究.pdf

1、目的：
　　1、通過經(jīng)消化道感染空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni，C.jejuni），構(gòu)建豚鼠周圍神經(jīng)損傷模型。
　　2、觀察豚鼠經(jīng)消化道感染空腸彎曲菌后，不同時(shí)間段內(nèi)周圍神經(jīng)的病理損傷有何差異，從而為建立空腸彎曲菌相關(guān)的周圍神經(jīng)病的動(dòng)物模型提供參考依據(jù)。
　　方法：
　　1、制備空腸彎曲菌菌懸液
　　選取自AMAM型GBS患者糞便中分離、培養(yǎng)的空腸彎曲菌lulei株，經(jīng)中國和美國疾病預(yù)

2、防控制中心鑒定為空腸彎曲菌。將該菌在42℃微需氧條件下(10％CO2、5％O2、85％N2)培養(yǎng)24小時(shí)后傳代至哥倫比亞血平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24小時(shí)，并連續(xù)傳至第3代純化菌株。并經(jīng)革蘭氏染色、馬尿酸水解實(shí)驗(yàn)以及分子生物學(xué)進(jìn)行細(xì)菌鑒定后，收取菌株制備成濃度為3×109CFU/ml的菌懸液。
　　2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
　　購買SPF級(jí)4周齡Hartley豚鼠55只，飼養(yǎng)一周。按照體重、體重增長速度及毛色等條件篩選出50只健康豚鼠。將

3、篩選出的50只健康豚鼠，隨機(jī)分為布氏肉湯組A（10只）、空白對照組B（10只）、實(shí)驗(yàn)組E(30只)。
　　根據(jù)不同的解剖時(shí)間（末次灌喂后第1、2、3、4、5周）將布氏肉湯組和對照組再次隨機(jī)分成5個(gè)亞組（各2只），布氏肉湯組A分別標(biāo)記為A1、A2、A3、A4、A5;空白對照組B分別標(biāo)記為B1、B2、B3、B4、B5;
　　根據(jù)不同的解剖時(shí)間（末次灌喂后第1、2、3、4、5周）將實(shí)驗(yàn)組30只豚鼠再次隨機(jī)分為5個(gè)亞組（各6只），分

4、別標(biāo)記為E1、E2、E3、E4、E5組。
　　若豚鼠出現(xiàn)癱瘓等明顯的臨床癥狀，因?qū)嶒?yàn)組的干預(yù)處理是統(tǒng)一的，可以將發(fā)生癱瘓的豚鼠合并為一組，標(biāo)記為實(shí)驗(yàn)組T。篩選后余下的5只豚鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，設(shè)為備用對照組，其中3只處理同布氏肉湯組，2只同空白對照組。
　　3、造模方案
　　實(shí)驗(yàn)組（E組）豚鼠給予灌喂活菌菌懸液，每只豚鼠在每次灌喂前禁食15小時(shí)、禁水4小時(shí)。每周中連續(xù)3天進(jìn)行灌喂菌液（1次/天），共進(jìn)行三周，每周的灌喂時(shí)間相同

5、。每只豚鼠灌喂完畢后，間隔半小時(shí)后立即給予食物及無菌水。實(shí)驗(yàn)組每只豚鼠每次灌喂3109CFU/ml的空腸彎曲菌菌懸液1ml;A組（布氏肉湯對照組）給予滅菌的布氏肉湯1ml;B組（空白對照組）不予處理。
　　4、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察及標(biāo)本取材
　　自灌喂當(dāng)日起每日觀察豚鼠的臨床癥狀（參考Hartley豚鼠EAN模型的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)病程度分為0～5級(jí)。0級(jí):正常;1級(jí):兩后腳趾稍拖拽地面;2級(jí):兩后腳趾明顯拖地;3級(jí):兩后肢顯著拖地，兩后

6、肢偏向同一側(cè);4級(jí):兩后肢完全癱瘓;5級(jí):四肢均癱瘓，甚至呼吸抑制[1]），定期稱量豚鼠體重，觀察豚鼠的活動(dòng)能力、精神狀況以及皮毛色澤，有無腹瀉等。
　　于末次灌喂后第1，2，3，4，5周分批解剖相應(yīng)的組別A1、B1、E1, A2、B2、E2, A3、B3、E3, A4、B4、E4, A5、B5、E5組。4％水合氯醛（10ug/g）麻醉豚鼠，灌注解剖后，分別取同側(cè)坐骨神經(jīng)近端保存于4％多聚甲醛中，擇期進(jìn)行鋨酸染色觀察周圍神經(jīng)病變。

7、
　　5、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
　　每個(gè)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本經(jīng)鋨酸染色后，隨機(jī)挑選100根神經(jīng)單絲，于光鏡下進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)出有病變的神經(jīng)單絲個(gè)數(shù)，計(jì)算出發(fā)病率（病變單絲數(shù)/100*100％），采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0根據(jù)病變率進(jìn)行x2檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察
　　1.1臨床癥狀
　　豚鼠經(jīng)空腸彎曲菌灌喂結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)組中共有6只豚鼠發(fā)病，其中4只在灌喂結(jié)束后即刻出現(xiàn)癱瘓，2只在灌喂結(jié)束后第4周出現(xiàn)癱瘓

8、。均表現(xiàn)為活動(dòng)力減弱，雙耳及唇部紫紺，呼吸急促，身體略有顫抖，雙后肢行動(dòng)差，腹部皮毛臟。自發(fā)病后當(dāng)天進(jìn)行麻醉豚鼠，灌注解剖取材。并將癱瘓的豚鼠合并為一組，標(biāo)記為實(shí)驗(yàn)組T，根據(jù)臨床癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分均為4-5級(jí)。其它實(shí)驗(yàn)組豚鼠略有脫毛現(xiàn)象，肢體活動(dòng)未見明顯異常，根據(jù)臨床癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分均為0級(jí)(Fig.5)。
　　1.2體重
　　自灌喂細(xì)菌后，實(shí)驗(yàn)組豚鼠體重略低于對照組，但是經(jīng)重復(fù)測量單因素方差分析后，實(shí)驗(yàn)組豚鼠體重和對

9、照組無顯著差異，P＞0.05，(Fig.6)。2周圍神經(jīng)病理表現(xiàn)
　　對照組豚鼠坐骨神經(jīng)纖維也存在纖維粗細(xì)不等，皺縮等現(xiàn)象(Fig.7);
　　各實(shí)驗(yàn)組中豚鼠坐骨神經(jīng)均有纖維粗細(xì)不等，髓鞘向內(nèi)側(cè)突起、節(jié)段性消失、皺縮、斷裂;髓鞘內(nèi)有卵圓狀物質(zhì)沉積，節(jié)旁區(qū)和郎飛結(jié)處多見;髓鞘外側(cè)成鋸齒樣，呈“長城樣”改變(Fig.8)。
　　3、神經(jīng)纖維病變率及統(tǒng)計(jì)分析:
　　3.1神經(jīng)纖維病變率
　　對照組豚鼠神經(jīng)單絲病理

10、存在形態(tài)上的異常，但是實(shí)驗(yàn)組和對照組豚鼠周圍神經(jīng)的形態(tài)存在顯著性差異(P＜0.05)，即實(shí)驗(yàn)組豚鼠的神經(jīng)單絲存在病變。
　　實(shí)驗(yàn)癱瘓組豚鼠神經(jīng)病變率為42.0％，實(shí)驗(yàn)組E1、E2、E3、E4、E5組病變率分別為15.3％，18.0％，29.0％，39.0％，38.7％(Table2)。
　　3.2病變率統(tǒng)計(jì)分析
　　布氏肉湯組和空白對照組豚鼠神經(jīng)纖維病變率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05(Table3)，可排除布氏肉湯對神經(jīng)

11、纖維的影響。
　　不同時(shí)間段解剖的空白對照組及布氏肉湯組豚鼠神經(jīng)纖維病變率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05(Table4)，可認(rèn)為不同的時(shí)間段解剖豚鼠對神經(jīng)病變率無影響。
　　不同時(shí)間段解剖的實(shí)驗(yàn)組豚鼠神經(jīng)纖維病變率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05(Table5)。認(rèn)為不同時(shí)間段解剖的實(shí)驗(yàn)組之間發(fā)病率不全相等，進(jìn)一步進(jìn)行組間比較，采用x2分割法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05，校正后檢驗(yàn)水準(zhǔn)α'=0.0033。
　　通過spss13.0曲

12、線擬合方法得出實(shí)驗(yàn)組豚鼠病變率和時(shí)間存在一定的依存關(guān)系(Table6)。結(jié)合x2分割組間比較，可得出豚鼠經(jīng)活菌灌喂后第4周(E4)神經(jīng)病變率和癱瘓組(T)豚鼠神經(jīng)病變率無差異，且此兩階段神經(jīng)病變率較其它時(shí)間段解剖的實(shí)驗(yàn)組高。
　　結(jié)論：
　　1、自AMAN型GBS患者糞便中分離培養(yǎng)的空腸彎曲菌經(jīng)消化道感染4周齡豚鼠能夠?qū)е码嗍笾車窠?jīng)損傷，但并不是所有的神經(jīng)單絲都有損傷，存在一定的病變率;部分豚鼠出現(xiàn)癱瘓等臨床癥狀。