空腸彎曲菌聯(lián)合百日咳毒素致Hartley豚鼠周圍神經(jīng)損傷的研究.pdf

1、目的:通過構建空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni，Cj）活菌口服灌胃，聯(lián)合腹腔注射百日咳毒素(pertussis toxin，PT)致Hartley豚鼠周圍神經(jīng)損傷的模型。探討空腸彎曲菌消化道感染后同時腹腔給予百日咳毒素對加重周圍神經(jīng)組織損傷的影響，進而為周圍神經(jīng)病——吉蘭-巴雷綜合征（Guillain-Barre syndrome，GBS）動物模型的建立提供實驗基礎。
　　方法:
　　1.空腸彎曲菌的培養(yǎng)

2、、鑒定及菌懸液的制備:選取吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barre syndrome，GBS)患者糞便中分離并培養(yǎng)出的空腸彎曲菌lulei株，經(jīng)中國疾病預防控制中心鑒定為空腸彎曲菌菌株。用哥倫比亞血培養(yǎng)基于42℃，10％CO2、5％O2、85％N2條件培養(yǎng)空腸彎曲菌。并經(jīng)革蘭染色、馬尿酸水解實驗及過氧化氫酶實驗進行鑒定。純化菌種，制備3×108cfu/ml菌懸液。
　　2.實驗動物分組:將30只Hartley豚鼠隨機分為實驗

3、組和對照組，實驗組分為:A組:空腸彎曲菌lulei株+百日咳毒素組，B組:空腸彎曲菌lulei株+生理鹽水組;對照組分為:C組:布氏肉湯+百日咳毒素組，D組:布氏肉湯+生理鹽水組，E組:空白對照組。
　　3.實驗動物攻毒:口服灌喂Hartley豚鼠，灌喂前禁食12小時、禁水4小時。實驗組A組、B組給予濃度為3×108cfu/ml的菌懸液，2ml/只，對照組C組、D組給予同等量的布氏肉湯進行灌胃。灌胃周期為每周連續(xù)3天且連續(xù)4周進行

4、。于第1周和第2周的第1次和第3次灌胃后，A組和C組腹腔注射0.5ml含1ug百日咳毒素的生理鹽水，B組、D組給予0.5ml生理鹽水。
　　4.實驗動物臨床癥狀、病理觀察及病變統(tǒng)計:自灌喂當日起每日觀察豚鼠的臨床癥狀，定期稱量豚鼠體重，觀察豚鼠的皮毛情況。于末次攻毒后1周取材，分別取雙側坐骨神經(jīng)進行鋨酸染色觀察及透射電鏡觀察，根據(jù)鋨酸染色病變率進行x2檢驗。
　　結果:
　　1.實驗動物觀察:根據(jù)臨床癥狀評分標準進行評

5、分，實驗組A組、B組和對照組C組、D組、E組臨床癥狀均為0級。實驗組A組有1只豚鼠于第3周開始出現(xiàn)腹部皮毛較臟現(xiàn)象。實驗組A組和B組整體體重增長速度較慢。實驗組A組、B組豚鼠與第3周開始有掉毛的現(xiàn)象。
　　2.周圍神經(jīng)病理表現(xiàn):
　　2.1 鋨酸染色:實驗組A組豚鼠坐骨神經(jīng)部分纖維粗細不等，髓鞘節(jié)段性皺縮、斷裂，呈“長城樣”改變，部分神經(jīng)單絲斷裂;實驗組B組豚鼠坐骨神經(jīng)部分纖維呈“鋸齒樣”改變，節(jié)段性皺縮，神經(jīng)纖維粗細不均勻

6、;對照組豚鼠坐骨神經(jīng)纖維鋨酸染色未見異常。
　　2.2 透射電鏡觀察:實驗組A組豚鼠坐骨神經(jīng)髓鞘粗細不等，板層結構消失，并出現(xiàn)斷裂缺如，部分軸索被壓迫消失;實驗組B組豚鼠坐骨經(jīng)髓鞘部分板層結構消失，融合紊亂，微絲微管排列緊密，線粒體嵴模糊。對照組神經(jīng)髓鞘粗細均勻，板層結構完整，微絲微管排列正常。
　　3.神經(jīng)纖維病變率及統(tǒng)計分析:
　　3.1 神經(jīng)纖維病變率:實驗組中周圍神經(jīng)存在損傷的Hartley豚鼠占100％，實驗

7、組和對照組Hartley豚鼠周圍神經(jīng)的平均病變率不同，實驗組A組病變率為47.3％，實驗組B組病變率為18.8％，對照組C組病變率為3.8％，對照組D組病變率為2.5％，空白對照組E組病變率為2.8％。
　　3.2 病變率統(tǒng)計分析:對資料進行x2檢驗，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，神經(jīng)纖維平均病變率比較采用x2檢驗，進行雙側性顯著檢測。檢驗水準取α=0.05。得出P＜0.05，認為各組的發(fā)病率不全相等。進一步進行組間

8、比較，采用x2分割法，檢驗水準取α=0.05，需進行A組、B組、C組、D組分別與E組比較，以及A組與B組比較，校正后檢驗水準α'=0.01。A組與E組比較，得出P＜0.01，認為A組和E組病變率不同，有統(tǒng)計學意義，且A組病變率高于E組病變率;B組和E組比較，得出P＜0.01，認為B組和E組病變率不同，有統(tǒng)計學意義，且B組病變率高于E組病變率;C組和E組比較，得出P＞0.01，認為C組和E組病變率相同，無統(tǒng)計學意義;D組和E組比較，得出P

9、＞0.01，認為D組和E組病變率相同，無統(tǒng)計學意義。A組和B組比較，得出P＜0.01，認為A組和B組病變率不同，有統(tǒng)計學意義，且A組病變率高于B組病變率。
　　結論:
　　1.消化道感染空腸彎曲菌能夠導致3周齡Hartley豚鼠周圍神經(jīng)損傷，周圍神經(jīng)存在損傷的豚鼠占100％，且周圍神經(jīng)纖維平均病損率為18.8％。
　　2.消化道感染空腸彎曲菌后進行腹腔注射百日咳毒素導致3周齡Hartley豚鼠周圍神經(jīng)損傷，周圍神經(jīng)存在